1.本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种缓解细菌耐药性的多肽及其药物组合物及两者的应用。


背景技术：

2.我国是畜牧业生产大国。抗生素在抑制病原菌生长，防控动物疫病发生，促进畜牧业发展方面发挥了重要作用。但随着抗生素耐药菌的迅速发展，抗生素药效越来越低，使用剂量越来越大，严重影响了畜产品质量安全和人民群众身体健康。为此，2020年国家全面实行“饲料端全面禁抗、养殖端全面限抗”政策，畜牧业的发展迎来重大挑战，迫切需要一方面挽救抗生素药效，一方面减少抗生素使用，促进畜牧业的发展。
3.联合用药是挽救抗生素药效、减少抗生素使用的可选方案之一。目前联合治疗方案主要集中于抗生素与抗生素的联合用药，且效果不佳，而抗生素与非抗生素的联合用药较少。在治疗鲍曼不动杆菌及其耐药菌株时，用传统治疗的抗生素碳青霉烯类药物已产生严重的耐药性，因此，找寻一种合理的抗菌药物组合具有重要的临床意义，比如黄连素与舒巴坦和阿米卡星联合用药，可以提高鲍曼不动杆菌对抗生素的敏感性。除了与抗生素联合用药的可用非抗生素药物较少外，其往往安全性较低，对动物体有一定的毒副作用，且有效性不高，很难大幅度提高抗生素药效，或需要很大剂量才能发挥作用。因此，有必要开发更多安全性和有效性更出色的联合用药物质。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种缓解细菌耐药性的多肽及其药物组合物，具有抑菌或杀菌的作用，很大程度上提高了细菌或耐药菌株对抗生素的敏感性，本发明还提供两者的应用。
5.本发明所述的缓解细菌耐药性的多肽，其氨基酸序列为 rvrrpvyipqprpphprl。
6.本发明所述多肽可按照其序列结构采用多肽合成仪合成。
7.本发明所述多肽是一种来源于蜜蜂淋巴系统的由氨基酸残基组成的抗菌活性阳离子多肽，分子量约为2.2kda。富含精氨酸和赖氨酸，通过与细菌胞外肽聚糖、脂多糖等带负电的分子作用，静电吸附至细菌细胞膜表面，亲水臂结合磷脂头且疏水臂插入脂膜内，最终在细胞表面“打孔”，细菌细胞内含物释放故而造成细菌的直接死亡，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等病原细菌具有很强的杀灭作用。由于多肽依赖物理静电作用，不涉及特定的分子靶位，不会诱导耐药性的产生，可用于耐药菌的清除。将多肽与抗生素联用，能将抗生素对耐药菌的最低抑菌浓度降低到敏感阈值以下，所以可以提高细菌(包括耐药菌)对抗生素的敏感性，并且可以延缓菌株耐药性的产生，对于促进畜牧业的发展具有重要意义。
8.本发明同时提供了缓解细菌耐药性的药物组合物，所述药物组合物包括抗生素和本发明所述的缓解细菌耐药性的多肽，优选地，所述多肽和抗生素的剂量比例按重量为1:
(10-20)。
9.优选地，所述细菌包括抗生素敏感菌和抗生素耐药菌。
10.优选地，所述药物组合物的成品制剂为口服剂或注射剂。
11.优选地，所述的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、头孢他啶、红霉素、四环素、克林霉素、巴洛沙星。其中，氨苄青霉素为青霉素类抗生素，头孢他啶为头孢菌类抗生素，巴洛沙星为喹诺酮类抗生素，卡那霉素和庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，红霉素为大环内酯类抗生素，四环素为四环素类抗生素，克林霉素为林可酰胺类抗生素，以上所述的抗生素类型包含了目前临床上使用的主要抗生素类型。
12.本发明的另一目的在于提供一种本发明所述的缓解细菌耐药性的多肽在提高细菌对抗生素敏感性和延缓耐药性发生方面的应用。
13.本发明还提供了一种本发明所述缓解细菌耐药性的药物组合物的应用，所述药物组合物用于缓解细菌耐药性。
14.优选地，所述细菌为大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的一种或多种。
15.本发明的有益效果：
16.本发明所述的多肽可以提高细菌包括耐药菌对抗生素的敏感性，还可以延缓菌株耐药性的产生，从而有效缓解细菌耐药性问题，减少抗生素的使用。本发明所提供的多肽，比单独采用抗生素解决病原菌感染问题具有更好的安全性和有效性，操作简单方便，对环境无污染。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1表示本发明所述多肽可以提高金黄色葡萄球菌对金霉素敏感性实验结果；
19.图2表示本发明所述多肽可以提高金黄色葡萄球菌对其他类抗生素的敏感性实验结果；
20.图3表示本发明所述多肽可以提高铜绿假单胞菌对青霉素类抗生素敏感性的实验结果；
21.图4表示本发明所述多肽可以提高多种细菌及其耐药菌株对青霉素类抗生素敏感性。
具体实施方式
22.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
23.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其
指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
24.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.金黄色葡萄球菌耐药菌株的筛选：
26.金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，食品受其污染的机会很多，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠埃希菌。
27.首先我们测定了多种常用抗生素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度 (mic)。实验结果显示氨苄青霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是 4μg/ml，卡那霉素的最小抑菌浓度是8μg/ml，庆大霉素的最小抑菌浓度是 8μg/ml，头孢他啶的最小抑菌浓度是4μg/ml，红霉素的最小抑菌浓度是16μg/ml,金霉素的最小抑菌浓度是4μg/ml,克林霉素的最小抑菌浓度是16μg/ml,巴洛沙星的最小抑菌浓度是4μg/ml。将菌落形成单位cfμ/ml为 1x108的原始菌液8种含1/2最小抑菌浓度的抗生素的lb液体培养基连续传代10次，再次测定传代后的单克隆的最小抑菌浓度，结果发现8种抗生素对该筛选菌株的mic值是原始菌株mic值的4-64倍，由此获得了耐8 种抗生素的金黄色葡萄球菌。
28.菌液的制备：将平板活化的金黄色葡萄球菌耐药菌株单菌落用无菌牙签挑取至10mllb液体培养基中，恒温振荡培养箱37℃，200r/min培养16h。离心收集菌液，6000rpm离心10min，除去上清后将收集到的样品用无菌 pbs缓冲液清洗彻底，最后用pbs缓冲液稀释至菌液浓度od值为0.5备用。
29.实施例1：本发明所述多肽可以提高金黄色葡萄球菌对金霉素的敏感性
30.为了验证本发明所述多肽是否有助于抗生素对耐药菌株的杀菌作用，设计了在抗生素金霉素中添加一定浓度的多肽实验。首先，配制70μg/ml 的金霉素溶液5份，再分别加入终浓度为0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、 1mg/ml、10mg/ml的多肽，充分溶解均匀后，加入按照上述操作制备好的菌液中，置37℃恒温振荡器200r/min培养3h，分别吸取100μl新鲜菌液涂布与提前准备好的lb营养琼脂培养基上，37℃培养24h后进行菌落计数。结果如附图所示，在添加多肽以后金霉素对金黄色葡萄球菌的杀菌率提高。具体的实验数据是，添加量是0.01mg/ml时，杀菌率提高了15倍，添加量是0.1mg/ml时，杀菌率提高了35倍，添加量是1mg/ml时，杀菌率提高了78倍，添加量是10mg/ml时，杀菌率提高了150倍。
31.实施例2：本发明所述多肽可以提高金黄色葡萄球菌耐药菌株对其他类抗生素的敏感性
32.为了研究添加一定比例的多肽后，金黄色葡萄球菌耐药菌是否对除了包括金霉素的四环素类的抗生素以外的其他抗生素有效，设计了下面的实验。按照上述制备金黄色葡萄球菌耐药菌，分别添加1mg/ml的多肽和对起始菌最小抑菌浓度的10倍的其他类抗生素，分别是氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、头孢他啶、红霉素、克林霉素、巴洛沙星等，作用4h后统计活菌数，计算杀菌率。结果表明，添加多肽后，金黄色葡萄球菌耐药菌对其他7种抗生素的敏感性提高了2-128倍。
33.实施例3：本发明所述多肽可以提高铜绿假单胞菌对青霉素类抗生素的敏感性
34.为了验证多肽是否有助于青霉素类抗生素对铜绿假单胞菌的杀菌作用，设计了在
抗生素氨苄青霉素中添加一定浓度的多肽实验。首先，配制 50μg/ml的氨苄青霉素溶液5份，再分别加入终浓度为0mg/ml、0.01mg/ml、 0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml的多肽，充分溶解均匀后，加入按照上述操作制备好的铜绿假单胞菌的菌液中，置37℃恒温振荡器200r/min培养3h，分别吸取100μl新鲜菌液涂布与提前准备好的lb营养琼脂培养基上，37℃培养24h后进行菌落计数。结果如附图所示，在添加多肽以后氨苄青霉素对铜绿假单胞菌的杀菌率提高了好多，而且在氨苄青霉素浓度一定的情况下，随着多肽含量的提高，对细菌的杀菌率也随之提高。具体的实验数据是，添加量是0.01mg/ml时，杀菌率提高了18倍，添加量是0.1mg/ml时，杀菌率提高了40倍，添加量是1mg/ml时，杀菌率提高了90倍，添加量是 10mg/ml时，杀菌率提高了198倍。
35.实施例4：本发明所述多肽可以提高多种细菌及其耐药菌株对青霉素类抗生素的敏感性
36.为研究添加多肽后，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌及其耐药菌株对青霉素类抗生素敏感性是否提高，按照上述制备以上3种菌的起始菌和耐药菌样品，分别添加10mg/ml的多肽和145μg/ml的氨苄青霉素，作用4h后，计算杀菌率。添加多肽后，对起始菌的杀菌率提高了5-10 倍，对其相应的耐药菌株的杀菌率提高了8-12倍。
37.综上所述，在抗生素中添加不同比例的多肽，可以提高金黄色葡萄球菌对金霉素和除金霉素以外的其他抗生素的敏感性，也可以提高除金黄色葡萄球菌以外的其他细菌及其耐药菌株对抗生素的敏感性，以上实验结果表明，可以通过在抗生素中添加不同浓度的多肽来提高细菌对抗生素敏感性的方法，以此来治疗细菌及其耐药菌株引起的症状。
38.实施例5：本发明所述多肽可以延缓金黄色葡萄球菌对抗生素耐药性的产生
39.选用上述制备的金黄色葡萄球菌原始菌株和常用的抗生素氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素，配制浓度为原始菌种最小抑菌浓度1/2的以上三种抗生素溶液，分别为2.5μg/ml的氨苄青霉素溶液、4μg/ml的卡那霉素溶液和3.125μg/ml的庆大霉素溶液，以上三种溶液各配制2份，备用。为了研究多肽是否会延缓金黄色葡萄球菌对多类抗生素耐药性的产生，再设一组对照试验，取用2.5μg/ml的氨苄青霉素溶液、4μg/ml的卡那霉素溶液和 3.125μg/ml的庆大霉素溶液各一份，分别加入10mg的多肽，备用。
40.将菌落形成单位cfu＝1x108的金黄色葡萄球菌原始菌液用浓度为2.5 μg/ml的氨苄青霉素、4μg/ml的卡那霉素和3.125μg/ml的庆大霉素的抗生素溶液与lb液体培养基连续传代10次，对照为加了10mg多肽的2.5μg/ml 的氨苄青霉素、4μg/ml的卡那霉素和3.125μg/ml的庆大霉素的抗生素溶液与lb液体培养基连续传代10次，挑取分别传代10次的单克隆，检测添加多肽和未添加多肽时氨苄青霉素、卡那霉素和庆大霉素对金黄色葡萄球的最小抑菌浓度。实验数据表明在筛选耐药菌株时，添加一定浓度的多肽，可以延缓金黄色葡萄球菌对抗生素耐药性的产生。在同一技术领域内，也可以推断添加多肽可以延缓除金黄色葡萄球菌以外的其他细菌对抗生素耐药性的产生。
41.42.实施例6：小鼠实验
43.取实验用小鼠100只，体重稳定在100g左右，全部静脉注射金黄色葡萄球菌新鲜菌液0.2ml，平均分配为5组，每组20只小鼠，每组分别静脉注射头孢他啶和多肽的混合溶液。第一组，注射4μg/ml的头孢他啶和生理盐水的混合溶液，第二组注射4μg/ml的头孢他啶和0.01mg/次/kg的多肽的混合溶液，第三组，注射4μg/ml的头孢他啶和0.1mg/次/kg的多肽的混合溶液，第四组，注射4μg/ml的头孢他啶和1mg/次/kg的多肽的混合溶液，第五组，注射4μg/ml的头孢他啶和10mg/次/kg的多肽的混合溶液，同等条件下培养后观察各组小鼠一周内死亡率。
44.死亡率数据统计表：
[0045][0046]
本发明通过添加不同浓度多肽以后，金霉素对金黄色葡萄球菌的杀菌率提高15-150倍，氨苄青霉素对铜绿假单胞菌的杀菌率提高18-198倍；添加1mg/ml多肽后，金黄色葡萄球菌耐药菌对氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、头孢他啶、红霉素、克林霉素、巴洛沙星等7种抗生素的敏感性提高了2-128倍；添加10mg/ml的多肽和145μg/ml的氨苄青霉素后，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的杀菌率提高了5-10倍，对其相应的耐药菌株的杀菌率提高了8-12倍，并且可以延缓金黄色葡萄球菌对氨苄青霉素、卡那霉素和庆大霉素耐药性的发生。
[0047]
尽管在本发明的实施例中，所列举的细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，但是，这些细菌并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为第一，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌是具有代表性的用于耐药性研究的耐药菌株；第二，以上菌株包含了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中，大肠埃希菌和铜绿假单胞菌属于革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性细菌，在人类生存和动植物养殖过程中容易感染的病原菌依据革兰氏染色就分为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，所以以上三种菌株作为实验菌株具有代表性。第三，以上三种菌株有耐药性和非耐药性两种状态，菌种的这种特性适合本发明的理念。
[0048]
本发明实施例所列举的抗生素为氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、头孢他啶、红霉素、金霉素、克林霉素、巴洛沙星，但是，这些抗生素也不能作为对本发明保护范围的限制。因为抗生素虽然数目较多，但是根据其化学结构和作用机制分为7大类，我们只需对每一类抗生素进行验证即可。根据化学结构的不同，抗生素分为青霉素类抗生素，头孢类抗生素，喹诺酮类抗生素，氨基糖苷类抗生素，大环内酯类抗生素，四环素类抗生素，利福霉素类抗生素，林可酰胺类抗生素。本发明所采用的氨苄青霉素为青霉素类抗生素，头孢他啶为头孢菌类抗生素，巴洛沙星为喹诺酮类抗生素，卡那霉素和庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，红霉素为大环内酯类抗生素，金霉素为四环素类抗生素，克林霉素为酰胺类抗生素，以上发明所采用的抗生素都具有代表性。所以，专业技术领域人员根据本发明的内容，就可以领会临床其他的抗生素也同样可以适用于本发明的内容。
[0049]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。