1.本发明涉及纳米铂制备领域，尤其涉及的是一种纳米铂的绿色合成方法及纳米铂在化妆品中的应用。
背景技术：
2.利用化学法生产铂纳米材料需要加入多种化学试剂，因此制备过程中易对环境和人体产生危害。生物纳米技术提供了合成具有多种生物特性的铂纳米粒子的独特方法。最近，铂纳米粒子(ptnps)在各种生物应用中引起了广泛的关注，包括癌症治疗、抗菌、热疗、药物控制释放、生物成像、生物传感和光消融治疗等。
3.如中国专利申请号为：cn201510663008.0，公开了一种追踪检测前列腺特异性抗原(psa)的智能检测系统，以及其核心模块电化学传感器的制备方法。
4.上述专利公开的技术方案中采用静电纺丝的纳米金(铂)、磁性纳米粒子等改性电极，并构建电化学传感器。本发明psa智能检测系统长时间追踪筛查对象psa水平，帮助医生更精确地评估该筛查对象患前列腺癌的风险，以避免假阳性的检测结果，避免过度治疗甚至错误治疗。本发明具有敏感、特异、选择性高的特点，在医学临床诊断领域具有重要应用前景。
5.现有技术中，探索了各种新的纳米粒子合成方法，包括光化学、电化学和辐射技术等。与化学或物理合成法相比，植物提取物介导的合成既环保又经济,反应通常在几分钟到2小时的时间内完成，无需担心化学物质残留。与基于微生物的绿色合成方法相比，植物介导的合成不需要开发复杂的微生物培养方式，也不存在微生物泄露的风险，从而避免对人类健康和环境产生危害。另外，植物所含有的物质具有重要的生物活性，可附着于纳米粒子表面，提高了纳米粒子的生物活性。
6.杜仲是我国特有的名贵经济树种。现代研究发现杜仲中含有蛋白质、脂肪、维生素、矿物质元素等营养成分，以及木质素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮多酚类、多糖类等药用成分，在降血压、血糖、血脂、护肝、护肾、护视力、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗衰老、抗病毒细菌、抗过敏和抗氧化等方面有显著的功效，且无毒副作用。用杜仲还原纳米铂，不仅成本低，安全性高，而且还提高了生物活性，更适合用于医疗保健和美容。
技术实现要素：
7.本发明所要解决的技术问题在于提供了一种纳米铂的绿色合成方法。
8.本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
9.一种纳米铂的绿色合成方法，包括以下步骤：
10.(1)取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:1-1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，0-100℃超声0.5-6h；
11.(2)离心机8000-15000r/min，离心10-30min，取上清，干燥后，得到杜仲提取物干粉；
12.(3)称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按1：100-10：100溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液；
13.(4)取提取液1-4ml加入氯铂酸0.001-0.1mol，剧烈搅拌0.5-3h，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
14.(5)将步骤(4)得到的纳米铂，8000-15000r/min，离心10-30min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
15.优选地，所述步骤(1)中取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:10的比例与超纯水混匀，得到混合液，0℃超声30分钟；
16.所述步骤(2)中控制离心机8000r/min，离心10分钟，取上清，干燥后得到杜仲提取物干粉；
17.所述步骤(3)中称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按1：100溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液；
18.所述步骤(4)中取提取液1ml加入氯铂酸0.001mol,剧烈搅拌30分钟，反应混合物从黄色变为黑色；
19.所述步骤(5)中将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
20.优选地，所述步骤(1)中取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:20的比例与超纯水混匀，得到混合液，30℃超声2h；
21.所述步骤(2)中控制离心机10000r/min，离心15分钟，取上清，干燥后得到杜仲提取物干粉；
22.所述步骤(3)中称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按2：100溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液；
23.所述步骤(4)中取提取液2ml加入氯铂酸0.001mol,剧烈搅拌1h，反应混合物从黄色变为黑色；
24.所述步骤(5)中将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000/min离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
25.优选地，所述步骤(1)中取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:50的比例与超纯水混匀，得到混合液，60℃超声4h；
26.所述步骤(2)中控制离心机12000r/min，离心20分钟，取上清，干燥后得到杜仲提取物干粉；
27.所述步骤(3)中称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按5：100溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液；
28.所述步骤(4)中取提取液3ml加入氯铂酸0.05mol,剧烈搅拌2h，反应混合物从黄色变为黑色；
29.所述步骤(5)中将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000/min离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
30.优选地，所述步骤(1)中取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6h；
31.所述步骤(2)中控制离心机15000/min，离心30分钟，取上清，干燥后得到杜仲提取
物干粉；
32.所述步骤(3)中称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按10：100溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液；
33.所述步骤(4)中取提取液4ml加入氯铂酸0.1mol,剧烈搅拌3h，反应混合物从黄色变为黑色；
34.所述步骤(5)中将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000/min离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
35.优选地，所述步骤(3)中杜仲提取物与水之间的比例为质量与体积之间的比例。
36.优选地，所述步骤(2)中的干燥方式为冻干干燥。
37.优选地，化妆品为面膜、精华液、面霜、眼霜或爽肤水中的任意一种
38.本发明同时公开上述纳米铂的绿色合成方法制备得到的纳米铂在化妆品中的应用。
39.本发明相比现有技术具有以下优点：
40.本发明公开一种纳米铂的绿色合成方法，具有如下优点：
41.1、本发明所采用的合成纳米铂的方法，无有机试剂污染，生产步骤简洁，成本低。
42.2、本发明所采用的合成方法，合成的纳米粒子稳定，杜仲提取物所含有的次生代谢物能与纳米粒子表面结合，防止聚集。
43.3、本发明提供的杜仲纳米铂，生物活性高，具有显著地抗氧化、抗衰老和美白作用。
44.4、本发明提供的纳米铂溶液能够清除dpph自由基，具有抗衰老能力，可以促进胶原蛋白合成，适合应用在化妆品中。
附图说明
45.图1为发明实例制得的纳米铂紫外吸收光谱图；
46.图2为发明实施例制得的纳米铂离子透射电镜图；
47.图3为发明实施例的纳米铂对dpph自由基的清除作用柱形图；
48.图4为发明实施例制得的纳米铂对hff-1成纤维细胞的毒性图；
49.图5为发明实施例制得的纳米铂对hff-1成纤维细胞i型胶原蛋白分泌的影响图；
50.图6为发明实施例制得的纳米铂对a375黑色素瘤细胞的毒性分析图；
51.图7为发明实施例制得的纳米铂对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制作用图。
具体实施方式
52.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
53.实施例1
54.(1)取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:10的比例与超纯水混匀，得到混合液，0℃超声30分钟；
55.(2)离心机8000转离心10分钟，取上清，冻干，得到杜仲提取物干粉；
56.(3)称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按1：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液。
57.(4)取提取液1ml加入氯铂酸0.001mol,剧烈搅拌30分钟，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
58.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
59.实施例2
60.(1)取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:20的比例与超纯水混匀，得到混合液，30℃超声2个小时；
61.(2)离心机10000转离心15分钟，取上清，冻干，得到杜仲提取物干粉；
62.(3)称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按2：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液。
63.(4)取提取液2ml加入氯铂酸0.01mol,剧烈搅拌1小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
64.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
65.实施例3
66.(1)取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:50的比例与超纯水混匀，得到混合液，60℃超声4个小时；
67.(2)离心机12000转离心20分钟，取上清，冻干，得到杜仲提取物干粉；
68.(3)称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按5：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液；
69.(4)取提取液3ml加入氯铂酸0.05mol,剧烈搅拌2小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
70.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
71.实施例4
72.(1)取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6个小时；
73.(2)离心机15000转离心30分钟，取上清，冻干，得到杜仲提取物干粉；
74.(3)称取步骤(2)得到的杜仲提取物，按10：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到杜仲提取液。
75.(4)取提取液4ml加入氯铂酸0.1mol,剧烈搅拌3小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
76.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
77.对比例
78.(1)取干燥的杜仲粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6个小时；
79.(2)离心机15000转离心30分钟，取上清，冻干，得到杜仲提取物干粉；
80.(3)将步骤(2)得到的杜仲提取物干粉溶于纯水中，即得对比例溶液。
81.分析实验
82.杜仲还原纳米铂紫外可见光度计分析；
83.在紫外可见光下，氯铂酸在262nm有吸收峰，杜仲提取物在282nm处有吸收峰，随着铂被还原，氯铂酸的吸收峰基本消失，同时还可以看到紫外到可见区整个谱带的吸收强度增加，如图1。
84.杜仲还原纳米铂透射电镜表征；
85.利用透射电子显微镜可以更直接地观察纳米粒子的形貌和大小，将不同实施例制得的纳米铂取出进行表征，由电子衍射图可以看出，实施例4制得的纳米粒子平均尺寸最小为2.1nm，见图2。
86.杜仲纳米铂对dpph自由基的清除作用柱形图；
87.用无水乙醇配置50μg/ml dpph工作溶液，避光保存，向实验组中加入100μl浓度为0.01mg/ml的杜仲纳米铂溶液和900μl的dpph工作液(a1)，向空白组中加入100μl浓度为10mg/l的杜仲纳米铂溶液和900μl的无水乙醇溶液(a2)，向对照组中加入100μl的无水乙醇溶液和900μl dpph工作液(a0)，混匀后，室温黑暗处静置半个小时，离心，去上清在517nm处测定吸光值。实施例1-4的测定结果如表1和图3所示。
88.根据以下公式计算dpph清除率：
89.dpph清除率(％)＝[1-(a1-a2)/a0]
[0090]
表1杜仲纳米铂清除dpph自由基的能力
[0091][0092][0093]
从表1和图3中可以看出，杜仲纳米铂实施例4对dpph的清除效率较高，在其浓度10mg/l时对自由基的清除率为71.74％，清除效果优于实施例1-3和对比例。
[0094]
杜仲还原纳米铂对hff-1成纤维细胞的毒性；
[0095]
取对数生长期、浓度为5000个/ml的人hff-1成纤维细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl，每个样品设3个复孔；将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养化。将浓度为0.25mg/l、1mg/l和2.5mg/l的杜仲纳米铂加入到96孔细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育24h；然后向每孔
中加入cck8溶液10μl，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育1-4h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。实施例1-4的测定结果如表2所示。
[0096]
以细胞存活率高于80％为对人hff-1成纤维细胞无毒的标准，从表2和图4中可以看出，实施例1-4中在浓度不高于2.5mg/ml时，对hff-1成纤维细胞没有毒性。
[0097]
表2为杜仲纳米铂对人hff-1成纤维细胞存活率(100％)的影响
[0098][0099][0100]
5、发明实施例制得的纳米铂对hff-1成纤维细胞i型胶原蛋白分泌的影响；
[0101]
取对数生长期、浓度为5000个/ml的人hff-1成纤维细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl；向实验组中分别加入10μl浓度为0.25mg/l、1mg/l、2.5mg/l的杜仲纳米铂，空白组中不加样品，分别于37℃孵育24h；收集细胞培养上清液，采用elisa法，用酶标仪在450nm处测定吸光值，计算出i型胶原蛋白的相对含量。实施例1-4的测定结果如表3和图5所示。
[0102]
表3杜仲纳米铂对hff-1成纤维细胞i型胶原蛋白分泌的影响
[0103][0104][0105]
由表3和图5可知，向hff-1成纤维细胞中添加本发明提供的浓度为2.5mg/l的杜仲纳米铂后，实施例四中，皮肤中的i型胶原蛋白含量为134％，说明本发明提供的杜仲纳米铂能够显著的促进i型胶原蛋白的表达，可以作为抗老因子添加到化妆品中。
[0106]
杜仲还原纳米铂对a375黑色素瘤细胞的毒性分析；
[0107]
取对数生长期、浓度为3000个/ml的人a375黑色素瘤细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl，每个样品设3个复孔；将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养化。将浓度为0.1mg/l、1mg/l和10mg/l的杜仲纳米铂加入到96孔细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育24h；然后向每孔中加入cck8溶液10μl，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育1-4h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。实施例1-4的测定结果如表4和图6所示。
[0108]
表4杜仲纳米铂对人a375黑色素瘤细胞存活率(100％)的影响
[0109][0110][0111]
以细胞存活率高于80％为对人a375黑色素瘤细胞无毒的标准，从表4和图6中可以看出，实施例1-4中的杜仲纳米铂在浓度不高于1mg/ml时，对a375黑色素瘤细胞没有毒性。
[0112]
7、发明实施例制得的纳米铂对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制效果；
[0113]
取对数生长期、浓度为106个/ml的人a375黑色素瘤细胞，取细胞200μl接种于有1ml培养液的35mm的细胞培养皿中，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中贴壁培养化；向实验组中分别加入10μl浓度为0.1mg/l、0.5mg/l、1mg/l的杜仲纳米铂，空白组中不加样品，分别于37℃孵育24h；吸弃细胞培养液，用pbs清洗2次，加入含有pmsf的1％的troton-x-100细胞裂解液100μl，迅速置于-20℃冷冻30分钟，4℃融化后收集样品，并于4℃离心15分钟，转速为12000rpm每分钟。收集上清，bca定量后，再加入4mg/ml的左旋多巴溶液100微升，37℃水浴3h,用酶标仪在490nm处测定吸光值，计算出酪氨酸酶的抑制效果。实施例1-4的测定结果如表5和图7所示。
[0114]
表5杜仲纳米铂对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制效果
[0115]
[0116][0117]
由表5和图7可知，在安全浓度范围内，纳米铂对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制率随着纳米铂浓度的升高而上升。添加本发明提供的浓度为0.1mg/l的杜仲纳米铂后，实施例4对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制率最高为61.5％，说明本发明提供的杜仲纳米铂能够显著的抑制酪氨酸酶的活性，可以作为美白因子添加到化妆品中。
[0118]
综上所述，本发明提供的杜仲纳米铂，具有良好的抗衰老、清除自由基、以及抑制酪氨酸酶的能力，可以作为化妆品添加剂加入到化妆品中。
[0119]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。