1.本发明涉及锌掺杂碳量子点技术领域，尤其涉及一种锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法及其应用。


背景技术：

2.碳量子点(carbon dots,cqds)是一种新型零维碳纳米材料，表面含有丰富的含氧官能团，作为电子受体和电子给予体，使其在光电子学，催化发光以及传感器领域具有广泛应用。近年来，为改变原始cqds表面结构单一，内部电子传递性能较差的缺点，现有表面功能化和杂原子掺杂两种功能策略，然而，使用聚合物或有机小分子的表面功能化存在着一些缺点，即不能在特定分析中占据功能化位置。因此，杂原子掺杂的cqds由于易于操作的特点，为改善cqds的发光特性和电子结构，提供了一种更有利的方法。由于不同金属具有不同的外层电子轨道，可以很好调节cqds的能带结构，可进一步作为cqds的电子给体，促进电子转移，提高荧光量子产率。xu等人以锰掺杂首次成功合成了具有可逆切换蓝色荧光的高光稳定性mn-cqds，荧光量子产率高达54.4％。yue等人采用水热法制备了钌掺杂的cqds，ru-cqds在水中具有较强的发光(qy＝20.79％)和高效的ros生成。实际上，金属掺杂的研究还处于起步阶段，研究发现金属掺杂的cqds不仅实现了qys的增强和荧光的调制，而且还发现了一些新的物理化学性质，如催化性能和弛豫性能。因此，合成并探究新型金属掺杂碳量子点的性能是很有必要的。
3.过氧化氢(h2o2)是一种典型的活性氧(ros)，作为细胞周期内的胞内信使，起着至关重要的作用。细胞内过氧化氢的过量产生与多种疾病有关，如心血管疾病，阿尔兹海默病，神经退行性疾病和各种癌症。此外，人体中多种代谢物(如胆固醇，黄嘌呤，葡萄糖，乳糖，胆碱，l-赖氨酸，丙酮酸等)通过酶催化反应生成h2o2。因此，开发一种有效的工具来检测h2o2是十分有必要的。现有h2o2的检测方法有滴定测定，电解分析，高效液相色谱法和分光光度法等，其中，荧光分析法由于响应时间快，简单，快速被认为是最有效的检测手段。但是有机染料和半导体量子点等多种荧光染料在荧光分析中具有细胞相溶性差，水溶性低的特点，因此将碳量子点引入作为荧光探针，具有易于合成，水溶性高，细胞毒性低等特点。


技术实现要素：

4.针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法及其应用，锌掺杂碳量子点荧光探针具有易于合成，水溶性高，细胞毒性低等特点，且制备出来的具有易于合成，水溶性高，细胞毒性低等特点，能够用于过氧化氢或者胆固醇的浓度检测。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
7.s1：通过水热法合成锌掺杂碳量子点zn-cqds；
8.s2：将步骤s1中合成的zn-cqds溶液稀释100倍，在比色管中，加入1.0ml的缓冲溶
液，0.06～0.18ml稀释后的zn-cqds溶液，0.5～3.0ml的0.1mol/lcu
2+
标准溶液，以及h2o2溶液；
9.s3：将步骤s2中的混合溶液在30～90℃下孵化0～120min，即得zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系。
10.进一步的，步骤s1的具体操作包括以下步骤，
11.s101：将醋酸锌、柠檬酸和乙二胺盐酸盐置于烧杯中，加入水使其充分溶解，得到前驱体溶液；所述醋酸锌、柠檬酸和乙二胺盐酸的质量比为66:63:40，醋酸锌与水的质量体积比为0.022:1g/ml；
12.s102：将步骤s101中得到的前驱体溶液在反应釜中反应、冷却、离心，得到澄清溶液；所述前驱体溶液在反应釜中的反应温度为180℃，反应时间为6h，冷却至室温后，用12000r
·
min-1
离心10min；
13.s103：将步骤s102中得到的澄清溶液过滤后，得到zn-cqds，3℃下冷藏保存备用。
14.进一步的，步骤s2中的缓冲溶液为hepes、巴比妥钠、trics-hcl、br、磷酸氢二钠-柠檬酸、pbs中的任一种。
15.进一步的，步骤s2中的缓冲溶液为hepes缓冲溶液，且hepes缓冲溶液的ph值为7.60；
16.zn-cqds溶液的加入量为0.16ml，0.1mol/lcu
2+
标准溶液的加入量为2.50ml。
17.进一步的，步骤s3中的孵化温度为50℃，孵化时间为40min。
18.进一步的，步骤s2中所述的h2o2溶液浓度为1.0
×
10-5
～1.0
×
10-6
mol/l。
19.进一步的，步骤s2中所述的h2o2溶液可以使用胆固醇溶液和胆固醇氧化酶溶液进行替换。
20.进一步的，所述胆固醇溶液的浓度为3.0
×
10-5
～9.0
×
10-7
mol/l；
21.所述胆固醇氧化酶的配制方法为：取2.5mg胆固醇氧化酶用ph＝7.60的hepes缓冲溶液充分溶解，配制成0.5mg/ml的胆固醇氧化酶溶液。
22.进一步的，一种锌掺杂碳量子点荧光探针在过氧化氢检测中的应用。
23.进一步的，一种锌掺杂碳量子点荧光探针在胆固醇检测中的应用。
24.本发明的有益效果是：
25.1、本发明锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法中先通过水热法一步合成了荧光量子产率高达34.32％的锌掺杂碳量子点zn-cqds，然后基于cu
2+
与h2o2产生羟基自由基可有效猝灭zn-cqds，制备了过氧化氢荧光探针体系，该过氧化氢荧光探针体系可直接用于过氧化氢的检测，且该氧化氢荧光探针体系的(f
0-f)/f0与h2o2浓度在1.0
×
10-5
～1.0
×
10-6
mol/l范围内呈良好的线性关系，检出限分别为7.2
×
10-7
mol/l，为h2o2生成反应的其他代谢物提供有效的检测思路。
26.2、本发明锌掺杂碳量子点荧光探针在制备过程中，可以将h2o2替换成胆固醇和胆固醇氧化酶溶液，从而形成胆固醇荧光探针体系；胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下生成h2o2，通过检测成h2o2的浓度可间接测定胆固醇的浓度，该胆固醇荧光探针体系的(f
0-f)/f0与与胆固醇浓度在3.0
×
10-5
～9.0
×
10-7
mol/l范围内呈良好的线性关系，检出限为6.8
×
10-7
mol/l。
27.3、将本发明中的荧光探针体系用于水样中h2o2和牛奶中胆固醇含量的测定，回收
率分别可达98.55％-105.4％和98.00％～103.0％，rsd≤3.8％，结果满意。
附图说明
28.图1为本发明中实施例一中zn-cqds的透射电镜图及粒径分布图；
29.图2为本发明中实施例一中zn-cqds的x射线粉末衍射图；
30.图3为本发明中实施例一中zn-cqds及cqds的红外光谱图；
31.图4为本发明中实施例一中zn-cqds的xps图全谱、zn 2p谱、c 1s谱及o1s谱；
32.图5为本发明中实施例一中不同激发波长下zn-cqds荧光谱图、zn-cqds紫外吸收和激发以及发射荧光光谱图；
33.图6为本发明实施例二中缓冲溶液ph值以及ph缓冲种类对zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系荧光强度的影响；
34.图7为本发明实施例三中cu
2+
的量对zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系荧光强度的影响；
35.图8为本发明实施例四中zn-cqds的量对zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系荧光强度的影响；
36.图9为本发明实施例五中孵化反应的时间和温度对zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系荧光强度的影响；
37.图10为本发明实施例六中不同干扰物质对zn-cqds-cu
2+
体系的影响结果。
38.图11为本发明实施例二至五中任一种过氧化氢荧光探针体系，以及实施例六中胆固醇荧光探针体系的(f
0-f)/f0分别随过氧化氢和胆固醇浓度变化的变化规律；
39.图12为本发明中过氧化氢荧光探针体系猝灭机理分析中不同zn-cqds体系的紫外-可见吸收光谱图和荧光光谱图；
40.图13本发明中过氧化氢荧光探针体系的反应机理图；
41.图14为本发明中zn-cqds，zn-cqds+cu
2+
，zn-cqds+cu
2+
+h2o2的荧光衰减曲线。
具体实施方式
42.为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
43.实施例一：
44.实施例一使用本发明中的水热法合成锌掺杂碳量子点zn-cqds，具体包括以下步骤，
45.s101：准确称取0.66g醋酸锌、0.63g柠檬酸和0.40g乙二胺盐酸盐置于烧杯中，加入30ml水使其充分溶解，得到前驱体溶液；
46.s102：将步骤s101中得到的前驱体溶液转移至30ml的反应釜中，在180℃条件下反应6h，冷却至室温后，将溶液用12000r
·
min-1
离心10min，除去沉淀，得到澄清溶液；
47.s103：将步骤s102中得到的澄清溶液用滤膜(0.22μm)过滤后，得到zn-cqds，3℃下冷藏保存备用。
48.附图1为合成的锌掺杂碳量子点zn-cqds的透射电镜图和粒径分布图，其中，(a)为zn-cqds的透射电镜图，(b)为zn-cqds的粒径分布图，从(a)中可以看出zn-cqds呈现球形，粒径均一，尺寸规则，单分散性能较好，清晰的晶格条纹间距为0.32nm。根据(b)也证实了
zn-cqds平均尺寸为2nm左右，主要分布在1.5-2.0nm范围内。
49.附图2是zn-cqds的x射线粉末衍射图，分别在2θ＝27.54
°
，2θ＝51.15
°
两处有明显的衍射峰，归为碳的特征衍射峰，表明所制zn-cqds具有良好的结晶度。
50.进一步的，为确定zn-cqds表面官能团，采用傅里叶红外对其表面官能团进行表征分析，结果如附图3所示。从图3中可以看出，zn-cqds在3448cm-1
处有一个明显的宽吸收带，可归因于n-h/o-h的伸缩振动。与未掺杂cqds相比，吸收峰强度显著增强。2352cm-1
处的强峰可能为o＝c＝o的伸缩振动。1658cm-1
为酰胺中c＝o的伸缩振动。c＝c键的伸缩振动在1556cm-1
处；1144cm-1
处的峰可能为醚键c-o-c的伸缩振动。以上分析表面明zn-cqds表面富有酰胺，羰基，羟基，醚键以及含氮官能团等基团，这些官能团使得zn-cqds表面易于修饰，且增加了其在水溶液中的亲水性及强荧光性。
51.进一步的，利用x射线电子能谱(xps)分析zn-cqds样品的组成，结果如附图4所示，其中，a、b、c、d、e分别为zn-cqds的xps图全谱、zn 2p谱、c 1s谱、o 1s谱和n1s峰。从附图4的a中可以看出，zn-cqds的全谱图显示4个主要峰：284.8ev的c1s峰，400.11ev的n 1s峰，531.65ev的o1s峰，1022.19ev的zn 2p峰。图4中b表明zn-cqds中的锌掺杂为zn
2+
掺杂，对应zn含量为1.47％。从图4的c中可以看出zn-cqds的c1s光谱主要由287.94ev，285.38ev，284.5ev三个子峰组成，这三个子峰分别对应于o-c＝o/c＝o，c＝c，c-c键。从图4的d中可以看出，o1s峰由位于532.9ev，531.6ev的两个子峰组成，分别对应于c＝o，c-o键。从图4的e中看出，n1s峰由399.93ev，401.42ev处这两个峰组成，分别对应于c-n和n-h键。这与红外光谱的分析结果是一致的。
52.进一步的，zn-cqds的荧光光谱及紫外-可见吸收光谱如附图5所示，其中，(a)为zn-cqds在不同激发波长下的荧光光谱，从(a)中可以看出，zn-cqds的发射具有很强的激发依赖性，当激发波长从250nm增加到390nm时，zn-cqds的发射峰从431nm蓝移至296nm，并且荧光强度先增大后降低，zn-cqds的激发依赖性可能是由于醋酸锌本身的性质决定的。图5的(a)中显示zn-cqds在激发波长为340nm处时荧光发射在428nm处最强。图5的(b)为zn-cqds的紫外可见吸收光谱，在图5的(b)中完整呈现了发射光谱与激发光谱具有镜像对称性，从(b)中的插图可见，zn-cqds在自然光下为无色，在强紫外光照射下发射强的蓝色荧光，与最佳340nm激发下发射蓝色荧光一致，而且zn-cqds在紫外区有238nm和340nm两处特征吸收，可能是由
─
oh、
─
nh的n
→
σ*跃迁和c＝o的n
→
π*跃迁。
53.进一步的，对zn-cqds的荧光量子产率进行分析，荧光量子产率(y)又称荧光量子效率，是指激发态分子中通过发射荧光而回到基态的分子占全部激发态分子的分数。采用在相同激发波长下，通过检测待测物与参比物的荧光强度和对该波长所激发光的吸收度，可利用公式进行计算。
54.本实施例中所用的硫酸奎宁为1.0
×
10-6
mol/l的标准溶液。实验数据如下表1所示，计算可得zn-cqds的荧光量子产率为34.32％，未掺杂cqds荧光量子产率为2.6％，进一步证明了锌掺杂cqds显著提升了碳量子点的荧光。
55.表1 zn-cqds与未掺杂cqds荧光量子产率对比结果
[0056][0057]
实施例二：
[0058]
一种锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤，
[0059]
s1：利用实施例一中的具体操作方法合成锌掺杂碳量子点zn-cqds；
[0060]
s2：将步骤s1中合成的zn-cqds溶液稀释100倍，在10ml比色管中，加入1.0ml ph值为7.60的hepes缓冲溶液，0.16ml稀释后的zn-cqds溶液，2.50ml的0.1mol/l cu
2+
标准溶液，以及适量的h2o2溶液；所述h2o2溶液的浓度为1.0
×
10-5
～1.0
×
10-6
mol/l；
[0061]
ph＝7.60hepes缓冲溶液的配制方法为：取2.39g n-(2-羟乙基)哌嗪-n
′‑
2-乙烷磺酸(hepes)配制为0.10mol/l的溶液，用0.20mol/l的naoh在酸度计上调节ph值为7.60。
[0062]
s3：将步骤s2中的混合溶液在50℃下孵化40min，即得zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系。该zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系可直接用于过氧化氢浓度的测定。
[0063]
本实施例中对不同类型以及不同酸碱度的缓冲溶液的猝灭效果进行了对比，在λem＝340nm，λex＝428nm下测定体系的荧光强度f以及试剂空白溶液的荧光强度f0，狭缝宽度均为5nm，计算(f
0-f)/f0，对比分析荧光猝灭性能((f
0-f)/f0)随缓冲溶液酸碱度的变化情况，结果如附图6所示，其中(a)为不同酸碱度的缓冲液的猝灭效果，(b)为不同类型的缓冲液的淬灭效果。从附图6(a)中可以看出，酸碱度在6.8～8.0之间时，体系的荧光猝灭性能最强，从附图6(b)中可以看出，在hepes缓冲溶液中荧光猝灭性能最强，因此体系选择ph＝7.60的hepes缓冲溶液，由于cu
2+
与h2o2作用对zn-cqds的猝灭达到最优状态。
[0064]
实施例三：
[0065]
一种锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤，
[0066]
s1：利用实施例一中的具体操作方法合成锌掺杂碳量子点zn-cqds；
[0067]
s2：将步骤s1中合成的zn-cqds溶液稀释100倍，在10ml比色管中，加入1.0ml ph值为7.60的hepes缓冲溶液，0.16ml稀释后的zn-cqds溶液，2.50ml的0.1mol/l cu
2+
标准溶液，以及适量的h2o2溶液；所述h2o2溶液的浓度为1.0
×
10-5
～1.0
×
10-6
mol/l；
[0068]
s3：将步骤s2中的混合溶液在50℃下孵化40min，即得zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系。该zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系可直接用于过氧化氢浓度的测定。
[0069]
本实施例中对不同cu
2+
标准溶液的猝灭效果进行了对比，在步骤s2中分别添加0.5～3.0ml的cu
2+
标准溶液进行对比，在λem＝340nm，λex＝428nm下测定体系的荧光强度f以及试剂空白溶液的荧光强度f0，狭缝宽度均为5nm，计算(f
0-f)/f0，对比分析荧光猝灭性能((f
0-f)/f0)随缓冲溶液酸碱度的变化情况，结果如附图7所示。从附图7中可以看出，随着cu
2+
用量的增加，体系荧光猝灭强度逐渐增大，在2.50ml达到最优，随着其浓度增加，催化产生羟基自由基的反应受到限制，体系荧光猝灭程度显著下降。
[0070]
实施例四：
[0071]
一种锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤，
[0072]
s1：利用实施例一中的具体操作方法合成锌掺杂碳量子点zn-cqds；
[0073]
s2：将步骤s1中合成的zn-cqds溶液稀释100倍，在10ml比色管中，加入1.0ml ph值为7.60的hepes缓冲溶液，0.16ml稀释后的zn-cqds溶液，2.50ml的0.1mol/l cu
2+
标准溶液，以及适量的h2o2溶液；所述h2o2溶液的浓度为1.0
×
10-5
～1.0
×
10-6
mol/l；
[0074]
s3：将步骤s2中的混合溶液在50℃下孵化40min，即得zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系。该zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系可直接用于过氧化氢浓度的测定。
[0075]
本实施例中对不同zn-cqds溶液的猝灭效果进行了对比，在步骤s2中分别添加0.06～0.18ml的zn-cqds溶液进行对比，在λem＝340nm，λex＝428nm下测定体系的荧光强度f以及试剂空白溶液的荧光强度f0，狭缝宽度均为5nm，计算(f
0-f)/f0，对比分析荧光猝灭性能((f
0-f)/f0)随zn-cqds浓度的变化情况，结果如附图8所示。从附图8中可以看出，随着zn-cqds的用量增加，体系荧光猝灭程度显著增强，在0.16ml时达到最佳。随着zn-cqds的持续增加，可能是zn-cqds出现团聚，导致体系荧光猝灭受到影响。
[0076]
实施例五：
[0077]
一种锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤，
[0078]
s1：利用实施例一中的具体操作方法合成锌掺杂碳量子点zn-cqds；
[0079]
s2：将步骤s1中合成的zn-cqds溶液稀释100倍，在10ml比色管中，加入1.0ml ph值为7.60的hepes缓冲溶液，0.16ml稀释后的zn-cqds溶液，2.50ml的0.1mol/l cu
2+
标准溶液，以及适量的h2o2溶液；所述h2o2溶液的浓度为1.0
×
10-5
～1.0
×
10-6
mol/l；
[0080]
s3：将步骤s2中的混合溶液在50℃下孵化40min，即得zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系。该zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系可直接用于过氧化氢浓度的测定。
[0081]
本实施例中对不同孵化温度和孵化时间进行了对比，在步骤s3中分别采用不同的孵化温度和孵化时间，在λem＝340nm，λex＝428nm下测定体系的荧光强度f以及试剂空白溶液的荧光强度f0，狭缝宽度均为5nm，计算(f
0-f)/f0，对比分析荧光猝灭性能((f
0-f)/f0)随孵化时间和孵化温度的变化情况，结果如附图9所示，其中(a)为不同孵化时间对比结果，(b)为不同孵化温度的对比结果。从附图9中可以看出，体系在50℃孵化40min后逐步趋于稳定。
[0082]
为了考察本发明中过氧化氢荧光探针体系的可靠性，以延河水为模拟水样经过滤处理之后，在实验最佳条件下进行测试并做加标回收实验，结果如下表2所示，h2o2的回收率在98.55％-105.4％，表明该体系可用于实际样品的检测。
[0083]
表2延河水中过氧化氢的加标回收实验(n＝3)
[0084][0085]
实施例六：
[0086]
一种锌掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤，
[0087]
s1：利用实施例一中的具体操作方法合成锌掺杂碳量子点zn-cqds；
[0088]
s2：将步骤s1中合成的zn-cqds溶液稀释100倍，在10ml比色管中，加入1.0ml ph值为7.60的hepes缓冲溶液，0.16ml稀释后的zn-cqds溶液，2.50ml的0.1mol/l cu
2+
标准溶液，以及适量的胆固醇标准溶液和100μl胆固醇氧化酶；所述胆固醇标准溶液的浓度为3.0
×
10-5
～9.0
×
10-7
mol/l；
[0089]
s3：将步骤s2中的混合溶液在50℃下孵化40min，即得zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系。该zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系可直接用于过氧化氢浓度的测定。
[0090]
所述胆固醇氧化酶的配制方法为：取2.5mg胆固醇氧化酶用ph＝7.60的hepes缓冲溶液充分溶解，配制成0.5mg/ml的胆固醇氧化酶溶液；
[0091]
所述胆固醇标准溶液的配制方法为：取0.019g胆固醇标准品用无水乙醇充分溶解，并定容至50ml，配制为1.0
×
10-3
mol/l胆固醇标准溶液，使用时逐级稀释。
[0092]
该zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系中胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下生成h2o2溶液，可通过测定h2o2溶液的浓度间接测定胆固醇溶液的浓度的，实际上与实施例一至实施例五中的zn-cqds-cu
2+
荧光探针体系反应机理是相同的。
[0093]
本实施例还考察了胆固醇浓度为1.0
×
10-5
mol/l(胆固醇标准溶液的浓度为3.0
×
10-5
～9.0
×
10-7
mol/l的范围内)时，荧光探针体系中常见离子及糖类对胆固醇荧光探针体系测定的影响。结果如图10所示(相对误差为5％范围内)，从图10中可以看出，1250倍的柠檬酸，250倍的乳糖，40倍的葡萄糖，120倍的po
43-、i-、na
+
、k
+
，65倍的so
42-、fe
3+
、mn
2+
，200倍的ca
2+
、mg
2+
对体系几乎没有干扰，故本方法在检测胆固醇中具有较好的选择性。
[0094]
进一步的，在λem＝340nm，λex＝428nm下测定实施例二至五中任一种过氧化氢荧光探针体系，以及实施例六中胆固醇荧光探针体系的荧光强度f以及试剂空白溶液的荧光强度f0，狭缝宽度均为5nm，计算(f
0-f)/f0，并在最佳实验条件下，测定(f
0-f)/f0随过氧化氢浓度变化的变化规律，结果如附图11所示。在附图11中，(a)和(b)为(f
0-f)/f0与h2o2浓度的线性关系，(c)和(d)为(f
0-f)/f0与胆固醇浓度的线性关系，从附图11中可以看出，(f
0-f)/f0与过氧化氢浓度在1.0
×
10-5
～1.0
×
10-6
mol/l范围内呈良好的线性关系，检出限达到7.2
×
10-7
mol/l；体系(f
0-f)/f0与胆固醇浓度在3.0
×
10-5
～9.0
×
10-7
mol/l范围内呈良好的线性关系，检出限为6.8
×
10-7
mol/l。相关系数r分别为0.9947和0.9924。
[0095]
实施例七：
[0096]
使用实施例六中的胆固醇荧光探针体系对超市购买的纯牛奶中的胆固醇进行检测，具体的，将超市购买的伊利纯牛奶分别从3袋中取5.00ml于离心管中，加入25ml(乙腈：水＝84：16)提取液，漩涡混匀1.0min，超声提取20min，中间振荡2-3次，取出于10000r/min离心机上离心5min，分别取上清液10μl在实验最佳条件下进行测试，并进行加标回收实验。结果如下表3所示，从表3中可以看出，该方法对实际样品的检测回收率在97.75％～103.00％，rsd≤4.76％，结果令人满意。与现有技术中的方法进行比较，结果如表4所示，从表4中可以看出，本发明中的胆固醇荧光探针体系在低浓度范围内灵敏度更高。
[0097]
表3牛奶样品中胆固醇的加标回收实验(n＝3)
[0098][0099]
表4不同胆固醇检测方法的结果比较
[0100][0101]
表4中，文献[14]为gorassini a,verardo g,fregolent s,et al.rapid determination of cholesterol oxidation products in milk powder based products by reversed phase spe and hplc-apci-ms/ms[j].food chemistry,2017,230:604-610；
[0102]
文献[15]为lin t,zhong l,chen h,et al.a sensitive colorimetric assay for cholesterol based on the peroxidase-like activity of mos2 nanosheets[j].microchimica acta,2017,184(4):1233-1237；
[0103]
文献[16]为zhu l,xu l,tan l,et al.direct electrochemistry of cholesterol oxidase immobilized on gold nanoparticles-decorated multiwalled carbon nanotubes and cholesterol sensing[j].talanta,2013,106:192-199；
[0104]
文献[17]为chang h,ho j a.gold nanocluster-assisted fluorescent detection for hydrogen peroxide and cholesterol based on the inner filter effect of gold nanoparticles[j].analytical chemistry,2015,87(20):10362-10367。
[0105]
过氧化氢荧光探针体系猝灭机理分析：
[0106]
基于cu
2+
与h2o2的类芬顿反应产生的高活性
·
oh有效猝灭荧光zn-cqds而建立了测定h2o2和生成h2o2的代谢物(如胆固醇，黄嘌呤，葡萄糖等)的体系。如附图12中的(a)所示，发现相同浓度的zn-cqds与未掺杂cqds都在340nm最大激发下于428nm处有强发射，但zn-cqds的激发与发射强度更强。h2o2本身对zn-cqds与cqds荧光几乎没有作用，cu
2+
对zn-cqds荧光有一定的猝灭作用，对未掺杂cqds的也具有猝灭效果。但当加入h2o2后，zn-cqds-cu
2+-h2o2体系的猝灭效果明显大于cqds-cu
2+-h2o2体系。从附图12的(b)可以发现，cu
2+
加入前后zn-cqds紫外吸收光谱并无变化，说明cu
2+
与zn-cqds表面的-oh、-cooh、-nh等基团发生电荷转移仅改变了zn-cqds激发态的能量产生动态猝灭作用。但当同时加入cu
2+
与h2o2后，
zn-cqds的荧光显著降低，如附图12的(a)所示，推断是cu
2+
与h2o2发生芬顿反应产生高活性的
·
oh所致。由于亚甲基蓝(mb)分子中有一个中间价态的硫原子对
·
oh有高度亲和性，因此发现在加入1.00ml 1.0
×
10-4
mol/l亚甲基蓝于体系中，原mb在664nm的最大吸收有明显降低(图12中(b)6所示)，体系的荧光强度恢复10％(图12中的(a)6所示)，极可能是cu
2+
和h2o2产生的
·
oh被亚甲基蓝捕获，导致体系荧光有一定恢复，然而亚甲基蓝对zn-cqds本身有抑制作用导致恢复能力较弱。由此推理得出此反应机理如附图13所示。
[0107]
进一步的，采用flsp920稳态瞬态荧光光谱仪测定zn-cqds，zn-cqds+cu
2+
体系和zn-cqds+cu
2+
+h2o2体系的荧光衰减曲线(结果如附图14所示)和加权平均荧光寿命(结果如下表5所示)分别为8.20ns，15.13ns，6.80ns。zn-cqds和zn-cqds+cu
2+
光寿命比值为τ1/τ2＝0.54；zn-cqds+cu
2+
体系和zn-cqds+cu
2+
+h2o2体系的荧光寿命比值为τ2/τ3＝2.23，说明cu
2+
对zn-cqds的荧光猝灭以及cu
2+
/h2o2产生的
·
oh对zn-cqds的荧光猝灭过程都为动态猝灭，cu
2+
与h2o2发生类芬顿反应产生的
·
oh，促使zn-cqds的荧光发生动态猝灭一致。
[0108]
表5zn-cqds，zn-cqds+cu
2+
体系和zn-cqds+cu
2+
+h2o2体系的加权平均荧光寿命对照表
[0109][0110]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。