一种近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶的制备及其在免疫层析检测中的应用
技术领域
1.本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶的制备及其在免疫层析检测中的应用。
背景技术：
2.近年来，随着移动医疗和家庭医疗的不断发展，研究者们不断寻求新型的发光材料作为发光探针，以实现高灵敏度和高精准测定血清中的各种疾病标记物，包括心梗标记物(ctni和myo)；细菌病毒感染标记物(crp、saa和pct)；糖尿病标记物(糖化血红蛋白)；术前感染性疾病标记物(hiv、梅毒、乙肝和丙肝)以及突发传染病等。其中，基于纳米金颗粒的检测方法发展较快，已经在孕检、感染和突发传染病检测等领域得到了快速的应用。但低灵敏度纳米金层析检测方法属于半定量检测，不适用于高灵敏度检测疾病指标的应用。荧光微球和量子点的使用提高了检测方法的灵敏度，并实现了定量化检测，但测试过程中荧光背景信号高，进而限制了其在低浓度待测物检测中的应用。稀土上转换纳米晶作为新一代的发光材料，具有反stoke发光位移大，发射光谱窄，可实现多指标多重检测；无光漂白性，发光稳定性好，可多次重复检测；激发光大多位于980或800nm，不能激发抗原或抗体等生物有机分子等特点，因此，可实现无背景干扰、高信号噪音比检测。
3.现阶段，典型的稀土上转换纳米晶为核壳结构yb和tm共掺杂纳米晶。但传统的核壳结构yb和tm共掺杂纳米晶是一种yb和tm裸核纳米晶，其发光强度明显低于量子点和荧光微球等发光材料。因此，提高核壳结构yb和tm共掺杂纳米晶的发光强度是研究的热点和重点。比如，中国发明专利zl201810629698.1提供了一种改良的核壳结构yb和tm共掺杂纳米晶，但该纳米晶的近红外发光仅较标准yb和tm裸核纳米晶的发光提高了4倍。且该专利所采用的核壳结构纳米晶的敏化离子yb高掺杂极易引起交叉弛豫荧光淬灭现象，导致其吸收980nm光子的能力得不到显著的提升。因此，有必要对核壳结构纳米晶作进一步的改进，以进一步提高纳米晶对980nm光的吸收能力，以实现免疫层析检测方法的零背景信号干扰的高灵敏实时检测。
技术实现要素：
4.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶的制备方法，合成了nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶，大大提高了纳米晶对980nm光的吸收能力，并以该核壳壳结构纳米晶作为免疫荧光探针来建立免疫层析检测的方法，从而实现无背景干扰、高灵敏检测疾病指标的免疫层析法。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.本发明提供了一种近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶的制备方法，该方法包括以下步骤：
7.s1、制备核nayf4：
8.s11、先将油酸与十八烯混合，再加入四水合乙酸钇，并加热到150-180℃在剧烈搅中反应120min，冷却后得到混合液；
9.s12、将氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液加入到步骤s11的混合液中，加热至120℃保持30min，然后在通氮气的情况下再升温至300-320℃反应60-90min；
10.s13、反应后的混合液经降温、洗涤和离心后得到β-nayf4，将β-nayf4分散在正己烷中，得到β-nayf4分散液；
11.s2、核壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％的合成：
12.s21、按氧化镱和氧化铥的质量百分比为98％：2％的比例将氧化镱和氧化铥溶于三氟乙酸水溶液中，90-100℃下加热至全部溶解，然后继续加热至完全干燥并冷却至室温；
13.s22、往步骤s21中加入三氟乙酸钠、油酸、十八烯以及步骤s13制备得到的β-nayf4分散液，升温至120-150℃保持30-60min，然后在通氮气的情况下再升温至300℃反应60min，用于生长壳层；
14.s23、步骤s22的溶液经冷却、洗涤和离心后得到核壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％，将核壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％分散在正己烷中，得到核壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％分散液；
15.s3、nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶的制备：
16.s31、将氧化钇加入到三氟乙酸水溶液中，90-100℃下加热至全部溶解，然后继续加热至完全干燥并冷却至室温；
17.s32、往步骤s31中加入三氟乙酸钠，油酸、十八烯和步骤s23制得的核壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％分散液，三氟乙酸钠、油酸和十八烯，加热到120-150℃保持30-60min，然后再升温到300-320℃保持60-90min，用于生长壳层；
18.s33、步骤s32的溶液经冷却、洗涤和离心后制得近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶，即nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶。
19.优选地，步骤s31中，所述氧化钇在三氟乙酸水溶液中的浓度为0.5-2mmol/6ml。具体地，所述氧化钇在三氟乙酸水溶液中的浓度为1mmol/6ml。
20.优选地，步骤s32中，所述三氟乙酸钠、油酸、十八烯和核壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％分散液的用量比为1mmol：10-20ml：10-20ml：1-10ml。具体地，所述三氟乙酸钠、油酸、十八烯和核壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％分散液的用量比为1mmol：15ml：15ml：5ml。
21.优选地，步骤s21中，所述氧化镱和氧化铥的总用量在三氟乙酸水溶液中的浓度为0.5-2mmol/6ml。具体地，所述氧化镱和氧化铥的总用量在三氟乙酸水溶液中的浓度为1mmol/6ml。
22.优选地，步骤s22中，所述三氟乙酸钠、油酸、十八烯和β-nayf4分散液的用量比为1mmol：10-20ml：10-20ml：1-10m l。具体地，所述三氟乙酸钠、油酸、十八烯和β-nayf4分散液的用量比为1mmol：15ml：15ml：5ml。
23.优选地，步骤s11中，所述油酸、十八烯与四水合乙酸钇的用量比为5-10ml：10-20ml：0.5-5mmol。具体地，所述油酸、十八烯与四水合乙酸钇的用量比为7.5ml：15ml：1mmol。
24.优选地，步骤s12中，所述氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液与十八烯的体积比为1-3:3。具体地，所述氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液与十八烯的体积比为2:3。
25.优选地，本发明涉及的三氟乙酸水溶液中，三氟乙酸的体积百分浓度为50％。
26.本发明还提供了采用上述的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶的制备方法制备得到的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶。
27.本发明还提供了上述的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶在免疫层析检测中的应用。
28.本发明还提供了一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测侧流试纸条，所述侧流试纸条为以权利要求8所述的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶为免疫标记的侧流试纸条，所述侧流试纸条由近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶、聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫、吸水垫组成，所述结合垫负载有结合抗体或者靶蛋白修饰的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶探针和羊抗鸡igy抗体修饰的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶探针。
29.优选地，结合抗体或者靶蛋白修饰的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶探针和羊抗鸡igy抗体修饰的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶探针的制备方法包括以下步骤：
30.(1)将nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶分散在正己烷中，得到nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶分散液，将nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶分散液和hcl溶液(0.1m)及乙醇混合振荡后得到混合液；然后将溶液置于室温下超声30min去除油酸配体。反应完后离心收集nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶(12000r，20min)，并用去离子水水洗2遍后重新分散在10ml去离子水中；
31.(2)将分散于水中的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶逐滴加入到含有paa的去离子水中并在室温下搅拌60min得到paa包封的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶。离心收集paa包封的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶并用去离子洗2遍后重新分散于10ml去离子水中；
32.(3)将paa包封的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶用mes缓冲溶液(ph 5.0-8.0)清洗三次后重新分散于mes缓冲溶液中。然后加入含有sulfo-nhs和edc的mes缓冲溶液(ph 5.0-8.0)并且缓慢震荡30min以使nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶被sulfo-nhs-活化，最后用mes缓冲溶液清洗三次后重新分散于mes缓冲溶液中。
33.(4)将蛋白或抗体如rbd或者鸡igy加入到上述nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶溶液中，缓慢震荡60分钟以获得蛋白或抗体偶联的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶。然后继续加入标记封闭液【含0.04m乙醇胺，1％(w/v)的牛血清蛋白(bsa)的水溶液】，缓慢震荡30分钟以封闭其他活化位点，经离心制得结合抗体或者靶蛋白修饰的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶探针和羊抗鸡igy抗体修饰的近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶探针。
34.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
35.本发明采用了核壳壳结构纳米晶的合成方案，利用这一方案可实现敏化离子yb高掺杂到98％，从而提高了纳米晶对980nm光的吸收能力；同时确定了中间壳层发光离子tm离子的掺杂比例为2％。在这一比例下实现了交叉弛豫淬灭现象和yb和tm间能量有效传递的平衡，最终使核壳壳结构纳米晶近红外发光强度大大提升(较标准yb和tm裸核纳米晶的发光提高了850倍)。然后利用这一高亮近红外发光纳米晶作为免疫荧光探针来建立免疫层析
检测的方法，从而实现无背景干扰、高灵敏检测疾病指标的免疫层析法。具体而言，本发明具有以下优点：
36.(1)本发明通过yb和tm稀土元素的掺杂，合成了nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶(六角相)。以yb吸收980nm光子，利用yb
→
tm的能量传递方式，使tm发射出800nm的荧光。本发明通过内部核、最外层惰性壳nayf4以及夹心中间层naf4:yb98％,tm2％形成的核壳壳结构可以限制激发能于中间层，并抑制高浓度yb掺杂引起的交叉弛豫淬灭现象，最终得到高亮度近红外发光的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4稀土上转换发光纳米晶；
37.(2)本发明提供的近红外激发和发射的上转换发光材料nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4表面含有大量油酸配体，利用paa所含有的多个羧基，将油酸修饰的纳米晶由油溶性转变成水溶性，然后通过edc/nhs对纳米晶表面裸露的羧基进行活化处理，使羧基与蛋白或抗体的氨基基团进行共价连接，从而使蛋白或者抗体偶联到纳米晶上，得到蛋白或者抗体修饰的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4纳米晶探针，以该纳米晶探针为免疫标记制备血清标记物发光检测侧流试纸条，最终开发得到一种基于近红外光激发和近红外检测的血清标记物(肌红蛋白、肌钙蛋白、降钙素原、糖化血红蛋白、hiv、乙肝、丙肝、新型冠状病毒等)免疫层析检测方法。
38.(3)在利用本发明的侧流试纸条进行实际体液标记物检测时，需将一定量的体液样品滴加到样品垫上，经过一定时间孵化后，使用便携式检测仪器(980nm激发，800nm检测；中国发明专利202021494870.6)对试纸条发光进行检测。由于基于nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4纳米晶的发光探针，其激发和发射光谱均位于近红外区，从而消除了纤维素膜、体液中的各种小分子、大分子物质对检测荧光信号的干扰，从而实现了免疫层析检测方法的零背景信号干扰的高灵敏实时检测。
附图说明
39.图1为为核壳壳结构nayf4@naf4:98％yb,2％tm@nayf4的xrd衍射谱图；
40.图2为核壳壳结构nayf4@naf4:98％yb,2％tm@nayf4的透射电镜图(柱状图提示核壳壳结构纳米晶的大小)；
41.图3为核壳壳结构nayf4@naf4:98％yb,2％tm@nayf4与常规nayf4:20％yb,1％tm纳米晶的荧光光谱对比图；
42.图4为专利zl201810629698.1公开的核壳结构yb和tm共掺杂纳米晶的荧光光谱对比图；
43.图5为以nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶为免疫荧光标记的侧流试纸条的示意图(
①
为样本垫，
②
为结合垫，
③
为t线，
④
为c线，
⑤
为吸水垫)；
44.图6为以nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶为免疫荧光标记的侧流试纸条的实物图；
45.图7为以nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶为免疫荧光标记的侧流试纸条测定的血清样品中sars-cov-2rbd-igg浓度与检测线和质控线800nm荧光强度的关系曲线图；
46.图8为以nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶为免疫荧光标记的侧流试纸
条的检测结果与罗氏化学发光检测仪检测结果的回归分析结果图(以elisa方法为对照)；
47.图9为以nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶为免疫荧光标记的侧流试纸条检测线的发射光谱图(以elisa方法为对照)。
具体实施方式
48.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
49.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
50.实施例1近红外发光yb和tm共掺杂核壳壳结构纳米晶(nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶)的制备
51.1、制备核nayf452.1)先将7.5ml油酸(oa)与15ml十八烯(ode)加入到三口烧瓶中，再加入1mmol的yac3，4h2o(四水合乙酸钇)，随后加热到160℃反应120min至完全溶解，以去除其中的水分和氧气，最后冷却至室温后得到混合液；
53.2)将10ml含有nh4f(1mmol)和naoh(1mmol)的甲醇溶液加到上述三口烧瓶的混合液中，并加热至120℃保持30min，以去除甲醇；然后通足量氮气并将混合物升温至300℃反应60min；
54.3)反应结束后，将得到的液体自然降温至100
°
以下后转移到离心管中，加入5ml无水乙醇，并超声震荡离心管，然后以12000r/min的转速离心5min，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，获得核nayf4。
55.最后用无水乙醇重复洗涤和离心操作3次，之后将核β-nayf4分散在5ml环己烷中，得到核nayf4分散液，备用。
56.2、核壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％的合成
57.1)将0.98mmol氧化镱和0.02mmol氧化铥加入到含有3mlh2o和3ml三氟乙酸的三口烧瓶中，98℃加热至完全透明，使其全部溶解。接着，直接加热至去除所有水分，使三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥，并冷却至室温。
58.2)在三口烧瓶中继续加入1mmol三氟乙酸钠，15mloa，15mlode和5ml步骤1的β-nayf4分散液，并升温至120℃除去水分和环己烷。然后在通足量氮气的情况下升温至300℃反应60min，用于生长壳层。
59.3)待步骤2)得到的溶液自然冷却到室温后加入10ml无水乙醇震荡洗涤，再12000r/min离心5min，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，获得核壳nayf4@naybf4.tm。
60.将制备得到的核壳nayf4@naybf4.tm分散于3ml环己烷中制备得到核壳nayf4@naybf4.tm分散液。
61.3、nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶的制备
62.1)将1mmol氧化钇加入到含有3mlh2o和3ml三氟乙酸的三口烧瓶中，98℃加热至完全透明，使其全部溶解；接着，继续加热至去除所有水分，直至完全干燥在三口烧瓶底部可
以得到白色粉末(即三氟乙酸稀土盐)，并冷却至室温；
63.2)在三口烧瓶中继续加入1mmol三氟乙酸钠，15mloa，15mlode和5ml步骤2制备的nayf4@naf4:yb98％,tm2％分散液，并升温至120℃保持45min，以除去水分和环己烷，然后在通氮气的情况下升温至300℃反应60min，用于生长壳层；
64.3)待步骤2)得到的溶液自然冷却到室温后加入10ml无水乙醇震荡洗涤，再12000r/min离心5min，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，获得nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶。
65.将得到的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶分散于环己烷中制备得到nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶分散液，备用。
66.对本实施例制备得到的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶进行xrd衍射分析。如图1所示的xrd衍射谱图可以看出，nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4纳米晶是六方相的晶相结构；
67.对本实施例制备得到的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶进行透射电镜观察。从图2可以看出，该核壳壳nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4纳米晶为单分散，粒径均一，圆形粒子，直径为30nm；
68.对本实施例制备得到的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶和核壳结构β-nayf4:20％yb,1％tm(标准yb和tm裸核纳米晶)在980nm激发下的发射光谱进行分析(使用中国发明专利202021494870.6公开的使用便携式检测仪器进行测试)。如图3所示，通过nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4纳米晶800nm近红外发光增强了850倍。而专利zl201810629698.1公开的核壳结构yb和tm共掺杂纳米晶的近红外发光仅较标准yb和tm裸核纳米晶的发光提高了4倍(如图4所示)。
69.其中，上述提及的核壳结构β-nayf4:20％yb,1％tm的制备方法如下：
70.1)先将7.5ml油酸(oa)与15ml十八烯(ode)加入到三口烧瓶中，再加入0.79mmol的yac3，4h2o(四水合乙酸钇)、0.2mmolybac3,4h2o(四水合乙酸镱)、0.01mmol tmac3,4h2o(四水合乙酸铥)，随后加热到160℃反应120min至完全溶解，以去除其中的水分和氧气，最后冷却至室温后得到混合液；
71.2)将10mlnh4f(1mmol)和naoh(1mmol)的甲醇溶液加到上述三口烧瓶的混合液中，并加热至120℃保持30min，以去除甲醇；然后通足量氮气并将混合物升温至300℃反应60min；
72.3)反应结束后，将得到的液体自然降温至100℃以下后转移到离心管中，加入5ml无水乙醇，并超声震荡离心管，然后以12000r/min的转速离心5min，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，获得核核壳结构β-nayf4:20％yb,1％tm。最后用无水乙醇重复洗涤和离心操作3次，之后将核壳结构β-nayf4:20％yb,1％tm分散在5ml环己烷中，得到核壳结构β-nayf4:20％yb,1％tm分散液。
73.实施例2基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测侧流试纸条的制备
74.本实施例的侧流试纸条是利用实施例1的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶为免疫标记的侧流试纸条，该侧流试纸条由nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶、聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫、吸水垫(whatman公司购买)组成；
75.其中，检测垫是由硝化纤维膜(硝酸纤维素膜)及平行画在硝化纤维膜上的检测线
和控制线组成；检测线是用1～2mg/ml的血清指标抗体画出的线，线宽为1～1.2mm，滴加体积量是1～1.2l/cm；控制线是用1～2mg/ml的羊抗鸡igy抗体溶液画出的线，线宽为1～1.2mm，滴加体积量是1～1.2l/cm；
76.结合垫负载有结合抗体或者靶蛋白修饰的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶探针和羊抗鸡igy抗体修饰的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶探针。
77.检测垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板的中部，在检测垫的检测线(t线)一侧，检测垫与结合垫搭接；结合垫的另一端和样本垫搭接；在检测垫的控制线(c线)一侧，吸水垫与检测垫搭接；结合垫、样品垫和吸收垫也都粘贴在聚氯乙烯支撑背板上(其结构如图5和图6所示)。
78.上述侧流试纸条的制备方法包括以下步骤：
79.1、制备结合抗体或者靶蛋白修饰的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶探针和羊抗鸡igy抗体修饰的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶探针(即稀土上转换发光探针的制备)
80.1)将5ml hcl溶液(0.1m)和5ml乙醇加入实施例1获得的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶(10ml)中；然后将溶液在室温下超声30min去除油酸配体；反应完后离心(12000r，20min)收集得到nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4纳米晶；用去离子水水洗2遍后，将nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4纳米晶分散在10ml去离子水中；然后将分散于水中的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4纳米晶逐滴加入到10ml溶解了50mg paa(聚丙烯酸)的去离子水中；室温下搅拌60min得到paa包封的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4；离心收集paa包封的nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4(简称paa包覆纳米晶)，并用去离子洗2遍后重新分散于10ml去离子水中，制得paa包覆纳米晶水分散液；
81.2)取200μlpaa包覆纳米晶水分散液加入ep管中，然后加入1mlmes缓冲液(ph6.0)重悬，14,000
×
g离心15min，弃上清；重复3次后将paa包覆纳米晶重悬于1mlmes缓冲液中；然后加入10ml含有1m sulfo-nhs和1m edc的mes缓冲液；且缓慢震荡30分钟；用mes的缓冲溶液清洗sulfo-nhs活化纳米晶3次后，重新分散于mes缓冲液(1ml)中。接着，加入120毫克rbd蛋白(新型冠状病毒抗原)或者鸡igy(购买自杭州启泰生物技术有限公司)，并缓慢震荡60分钟；
82.然后继续加入1ml标记封闭液【含0.04m乙醇胺，1％(w/v)的牛血清蛋白(bsa)的水溶液】，缓慢震荡30分钟以封闭其他活化位点。经离心(14,000
×
g离心15min)后获得rbd或鸡igy偶联的纳米晶探针，即rbd或鸡igy偶联的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶探针。
83.最后，用标记终洗液【10mm tris-base缓冲液，含1％(w/v)牛血清蛋白，1％(v/v)tx-100，0.1％(v/v)吐温-20，0.3％(v/v)proclin-300，ph＝8.0】清洗三遍后重新将蛋白或抗体偶联的nayf4@nayf4:yb,tm@nayf4核壳壳结构纳米晶分散于200μl标记终洗液中，形成rbd或鸡igy偶联的纳米晶探针分散液(浓度为1～2mg/ml)，以备用。
84.2、组装侧流试纸条
85.1)用含1％(v/v)吐温-20的pb缓冲液浸泡玻璃纤维膜2～4h；然后放入45℃的鼓风干燥箱中烘24h；烘干后的玻璃纤维膜用自动切割仪切割成宽17mm，长300mm的长条状，得到备用样品垫；
86.2)用含1％(v/v)吐温-20的pb缓冲液浸泡聚酯纤维膜2～4h；然后放入45℃的鼓风干燥箱中烘24h；烘干后的聚酯纤维膜用自动切割仪切割成宽8mm，长300mm的长条状，得到备用结合垫；
87.3)将硝酸纤维素膜粘贴在聚氯乙烯支撑背板(78mm
×
300mm
×
0.33mm)的中部；在硝酸纤维素膜的检测线一侧，将备用结合垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上，并使硝酸纤维素膜与备用结合搭接2mm；备用样品垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上并使备用样品垫与备用结合垫搭接2mm；在硝酸纤维素膜的质控线一侧，将吸水垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上并使吸收垫与硝酸纤维素膜搭接2mm(示意图和实物图分别如图5和图6所示)；
88.4)用20mm tris-base缓冲液为溶剂，加入5％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.3％(w/v)牛血清蛋白、0.5％(v/v)pvp(k-30)、5％(v/v)s9(s9表面活性剂)、0.3％(v/v)proclin-300、8％(v/v)rbd偶联的纳米晶探针分散液、3％(v/v)鸡igy偶联的纳米晶探针分散液；用喷金划膜仪以50mm/s的喷涂速度和4μl/cm的喷涂量喷涂于聚氯乙烯支撑背板中的备用结合垫上；
89.5)用喷金划膜仪以50mm/s的划膜速度和1μl/cm的划膜量分别将1mg/ml的鼠源抗人igg抗体(购买自杭州启泰生物技术有限公司)溶液和1mg/ml的羊抗鸡igy抗体(购买自杭州启泰生物技术有限公司)溶液划于聚氯乙烯支撑背板的硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置。划膜后的pvc胶板置于45℃的鼓风干燥箱中烘12-24小时；
90.6)将烘干的试纸用自动切割机切割成3.98毫米宽的试纸条，装入塑料卡壳中(如图2所示)，即制备得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测侧流试纸条，也称yb和tm共掺核壳壳结构纳米晶sars-cov-2rbd-igg测定试纸条。
91.本实施例制备的以nayf4@naf4:yb98％,tm2％@nayf4核壳壳结构纳米晶为免疫荧光标记的侧流试纸条的使用方法为：将20微升和80微升缓冲液【20mm tris-base，0.85％(w/v)nacl，0.5％(w/v)tx-100，0.1％(v/v)吐温-20，0.1％(w/v)s9，ph 8.0】分别加入样本垫，静置15min，然后利用便携式检测仪器(具体见专利202021494870.6)检测试纸条中检测线和控制线在800nm处的荧光信号；然后根据测定的发光强度与标准样品sars-cov-2rbd-igg抗体(购买自近岸蛋白科技有限公司)的浓度制定标准曲线；将检测样本的荧光信号和标准曲线进行比对来获取样本中的sars-cov-2rbd-igg抗体的浓度；
92.实施例3基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测侧流试纸条的检测限
93.探究实施例2制备的侧流试纸条测定sars-cov-2rbd-igg抗体的检测限，具体方法如下：
94.1)sars-cov-2rbd-igg抗体标准品(购买自近岸蛋白科技有限公司)添加到疫情前不含sars-cov-2rbd-igg抗体的血清样品中，制备成sars-cov-2rbd-igg抗体浓度分别为0ug/ml，0.05ug/ml，0.1ug/ml，1ug/ml，5ug/ml，10ug/ml，20ug/ml的一系列的血清样品；
95.2)将20微升各浓度的血清样本加入试纸卡加样孔(实施例2的侧流试纸条)，然后加入80微升样本tris缓冲液【20mm tris-base，0.85％(w/v)nacl，0.5％(w/v)tx-100，0.1％(v/v)吐温-20，0.1％(w/v)s9，ph 8.0】；静置15min后，用便携式检测仪器(中国发明专利202021494870.6)对侧流试纸条的检测线和控制线进行800nm发射光测试，采集检测线在800nm处的发射光信号强度，各样品的sars-cov-2rbd-igg抗体浓度与测试结果的柱状图如图7所示。从图7可以看出，该侧流试纸条的检测限为0.016μg/ml。
96.实施例4基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测侧流试纸条(简称nir-lfa法)和elisa方法在测定covid-19康复患者临床血液样本中的阳性检测率对比
97.1)收集16份疫情前正常人血清和35份covid-19康复患者血清；
98.2)每孔添加50ng rbd包被酶联免疫吸附测定板；用含5％牛奶的磷酸盐缓冲盐水缓冲液(pbst)封闭酶联免疫吸附测定板；用含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水缓冲液洗涤酶标板2次。然后以每孔100μl稀释血浆(1:200)加入酶联免疫吸附测定板的测试孔中，37℃孵育1小时。用pbst洗涤酶标板4次，然后以每孔100μl稀释后的抗人igg抗体(1:8000)加入酶联免疫吸附测定板中，37℃孵育1小时。用pbst洗涤酶标板4次，加入50μl tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，室温孵育5min，再加入50μl 1m h2so4溶液终止显色反应。最后，采用瑞士tecan sunrise微孔板吸光度仪测定450nm处的吸光度。
99.3)将20微升血清样本加入到试纸卡(实施例2的侧流试纸条)的加样孔中，然后加入80微升样本tris缓冲液【20mm tris-base，0.85％(w/v)nacl，0.5％(w/v)tx-100，0.1％(v/v)吐温-20，0.1％(w/v)s9，ph 8.0】；静置15min后，用便携式检测仪器(中国发明专利202021494870.6)对侧流试纸条的检测线和控制线进行800nm发射光测试，采集检测线在800nm处的发射光信号强度。
100.各样品的sars-cov-2rbd-igg抗体浓度与测试结果的柱状图如图8示。从图8以看出，该yb和tm共掺核壳壳结构纳米晶sars-cov-2rbd-igg测定试纸条在covid-19康复患者临床血液样本中的sars-cov-2rbd-igg检出率明显高于elisa方法。
101.实施例5基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测侧流试纸条(简称nir-lfa法)和elisa方法在测定正常人接种sars-cov-2灭活疫苗后的血液样本中的sars-cov-2rbd-igg阳性检测率对比
102.1)收集19份未接种疫苗且无covid-19病史的正常人血清和60份正常人接种sars-cov-2灭活疫苗后的血液样本；
103.2)将20微升血清样本加入试纸卡(实施例2的侧流试纸条)的加样孔，然后加入80微升样本tris缓冲液【20mm tris-base，0.85％(w/v)nacl，0.5％(w/v)tx-100，0.1％(v/v)吐温-20，0.1％(w/v)s9，ph 8.0】；静置15min后，用便携式检测仪器(中国发明专利202021494870.6)对侧流试纸条的检测线和控制线进行800nm发射光测试，采集检测线在800nm处的发射光信号强度。
104.3)每孔添加50ng rbd包被酶联免疫吸附测定板；用含5％牛奶的磷酸盐缓冲盐水缓冲液封闭酶联免疫吸附测定板；用含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水缓冲液(pbst)洗涤酶标板2次。然后以每孔100μl稀释血浆(1:200)的量加入到酶联免疫吸附测定板的测试孔中，37℃孵育1小时。用pbst洗涤酶标板4次，然后以每孔100μl稀释后的抗人igg抗体(1:8000)的量加入到酶联免疫吸附测定板中，37℃孵育1小时。用pbst洗涤酶标板4次，加入50μltmb，室温孵育5min，再加入50μl 1m h2so4溶液终止显色反应。最后，通过瑞士tecan sunrise微孔板吸光度仪测定450nm处的吸光度。
105.各样品的sars-cov-2rbd-igg抗体浓度与测试结果的柱状图如图9所示，从图9看出，该yb和tm共掺核壳壳结构纳米晶sars-cov-2rbd-igg测定试纸条在灭活疫苗接种后的正常人血液样本中sars-cov-2rbd-igg检出率明显高于elisa方法。
106.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对
于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。