1.本发明涉及过氧化氢含量检测技术领域，尤其涉及一种比率型荧光探针及其制备方法和在检测过氧化氢中的应用。


背景技术：

2.过氧化氢被广泛应用于食品、环境、制药等工业领域。然而，h2o2的滥用可能导致dna的损伤和凋亡，并与植物抵御病原体和各种人类疾病(如癌症、阿尔茨海默病和帕金森病)显著相关。因此，开发快速、可靠的h2o2检测方法对于食品安全、环境保护和维护人类健康具有重要作用。目前，用于h2o2检测的方法主要有高效液相色谱法、电化学法、荧光法和比色法等。其中，荧光光谱技术具有灵敏度高、选择性好、响应时间短和实时监测能力强等特点，在生物分子检测中具有良好的应用前景。
3.目前，各种荧光分子探针已被用于h2o2检测，如2’,7
’‑
二氯二氢荧光素(dcfh)、萘酰亚胺和10
‑
乙酰
‑
3,7
‑
二羟基苯恶嗪(amplex red)，它们通常利用探针分子的化学基团作为反应位点，通过测量单个发射峰的荧光强度来检测h2o2，由于其单发射类型，其传感稳定性容易受到周围环境因素的影响。相较于传统的单荧光信号探针，具有内置校正功能的比率型荧光探针通过将两个发射位点的荧光强度的比值作为输出信号，可提供更高的稳定性。另外，比率型荧光探针在溶液中不受保护的荧光量子点易于发生聚集现象，这将对其传感性能产生影响，进一步降低了比率型荧光探针的稳定性。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种比率型荧光探针及其制备方法和在检测过氧化氢中的应用。本发明制得的比率型荧光探针含有金属有机框架和氧化钼量子点，提高了检测结果的稳定性。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
7.将可溶性钴盐、可溶性锌盐、氧化钼量子点溶液、4,4'
‑
联苯甲酸和n,n
‑
二甲基甲酰胺混合，进行水热反应，得到所述比率型荧光探针。
8.优选地，所述可溶性钴盐中钴离子与可溶性锌盐中锌离子的摩尔比为0.5～4:1。
9.优选地，所述可溶性钴盐中钴离子与4,4'
‑
联苯甲酸的摩尔比为1:1.2。
10.优选地，所述水热反应的温度为110～130℃，时间为12～24h。
11.优选地，所述氧化钼量子点溶液由包括以下步骤的方法制得：
12.将mos2纳米粉末与h2o2溶液混合，得到混合液；
13.调节所述混合液的ph值为6～8后进行氧化还原反应，得到氧化还原反应物；
14.将所述氧化还原反应物进行离心，得到所述氧化钼量子点溶液。
15.本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制得的比率型荧光探针，包括co/
zn
‑
mofs和氧化钼量子点，所述氧化钼量子点负载在所述co/zn
‑
mofs的表面，所述比率型荧光探针具有绣球花状结构。
16.本发明还提供了上述技术方案所述的比率型荧光探针在检测过氧化氢中的应用。
17.优选地，所述应用包括以下步骤：
18.在黑暗条件下，将所述比率型荧光探针与邻苯二氨溶液混合，得到混合液；
19.将所述混合液与待测物混合后进行孵育，得到孵育物料；所述待测物中含有h2o2；
20.对所述孵育物料进行荧光检测，得到荧光强度；
21.以标准方程计算待测物中h2o2的含量，所述标准方程是以h2o2摩尔浓度为自变量、荧光强度为因变量的方程。
22.优选地，所述荧光检测的波长为330nm。
23.优选地，所述比率型荧光探针与邻苯二氨溶液中邻苯二氨的质量比为5:8。
24.本发明提供了一种比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将可溶性钴盐、可溶性锌盐、氧化钼量子点溶液、4,4'
‑
联苯甲酸和n,n
‑
二甲基甲酰胺混合，进行水热反应，得到所述比率型荧光探针(moo
x qds@co/zn
‑
mofs)。本发明制备的moo
x qds(纳米酶)和co/zn
‑
mofs均具有催化活性，co/zn
‑
mofs大的比表面积和多孔结构能为纳米酶和底物之间的接触提供更多的结合位点，且co/zn
‑
mofs具有类似于天然酶的高催化活性。当具有荧光性质的纳米酶遇到具有相似催化活性的co/zn
‑
mofs时，会碰撞出“协同催化”的火花，两者的融合起到协同催化的作用；此外，co/zn
‑
mofs均匀的空腔可以为纳米酶提供“寄宿”，co/zn
‑
mofs为moo
x qds提供“锚点”，避免了moo
x qds的聚集，增强了探针的稳定性。因此，基于具有荧光性质的纳米酶和co/zn
‑
mofs材料来构建荧光探针以增强h2o2检测的灵敏度和稳定性，将具有重要的研究意义和应用价值。
25.本发明提供的制备方法合成简单，原料用量少、价格相对较低，产物产率高。
26.本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制得的比率型荧光探针，包括co/zn
‑
mofs和氧化钼量子点，所述氧化钼量子点负载在所述co/zn
‑
mofs的表面，所述比率型荧光探针具有绣球花状结构，增大了与底物的接触面积，使得催化活性得到充分发挥，提高了体系的检测灵敏度，弥补了传统方法检测速度慢、检测成本高或检测稳定性差、灵敏度低的不足。
附图说明
27.图1为moo
x qds@co/zn
‑
mofs探针检测h2o2原理图；
28.图2中(a)为moo
x qds的制备示意图，(b)为moo
x qds的tem图，(c)为moo
x qds@co/zn
‑
mofs的制备示意图，(d)为moo
x qds@co/zn
‑
mofs的sem图；
29.图3中(a)为制得的材料的xrd，(b)制得的材料的ft
‑
ir图，(c)为moo
x qds@co/zn
‑
mofs的xps全谱图，(d)为co 2p分谱图，(e)为mo 3d分谱图，(f)为zn 2p分谱图；
30.图4中(a)为制得的探针在暴露于不同浓度h2o2下的荧光光谱图，(b)为制得的探针的响应信号随h2o2浓度变化关系图；
31.图5中(a)为所制得的对干扰物的响应值(其中h2o2浓度为5.0μmol/l，干扰物浓度为50μmol/l)，插图为探针在干扰物存在下的荧光颜色变化，(b)为所制得的在暴露于5.0μmol/l h2o2和相同浓度干扰物下的荧光光谱。
32.图6为所制得的探针在储存0～30天后的响应值。
具体实施方式
33.本发明提供了一种比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
34.将可溶性钴盐、可溶性锌盐、氧化钼量子点溶液、4,4'
‑
联苯甲酸和n,n
‑
二甲基甲酰胺混合，进行水热反应，得到所述比率型荧光探针。
35.在本发明中，所述可溶性钴盐中钴离子与可溶性锌盐中锌离子的摩尔比优选为0.5～4:1，更优选为2:1。在本发明中，所述可溶性钴盐优选为co(no3)2·
6h2o，所述可溶性锌盐优选为zn(no3)2·
6h2o。
36.在本发明中，所述可溶性钴盐中钴离子与4,4'
‑
联苯甲酸的摩尔比优选为1:1.2。
37.在本发明中，所述可溶性钴盐中钴离子与n,n
‑
二甲基甲酰胺的用量比优选为1mmol:20ml。
38.在本发明中，所述水热反应的温度优选为110～130℃，更优选为120℃，时间优选为12～24h。
39.在本发明中，所述水热反应优选在反应釜中进行。
40.在本发明中，所述氧化钼量子点溶液优选由包括以下步骤的方法制得：
41.将mos2纳米粉末与h2o2溶液混合，得到混合液；
42.调节所述混合液的ph值为6～8后进行氧化还原反应，得到氧化还原反应物；
43.将所述氧化还原反应物进行离心，得到所述氧化钼量子点溶液(moo
x qds溶液)。
44.本发明将mos2纳米粉末与h2o2溶液混合，得到混合液。
45.在本发明中，所述mos2纳米粉末与h2o2溶液的用量比优选为20.0mg:20ml，所述h2o2溶液优选由30wt％的双氧水与水按照体积比2:3混合制得。在本发明中，所述mos2和h2o2分别用作钼源和氧化剂。
46.得到混合液后，本发明调节所述混合液的ph值为6～8后进行氧化还原反应，得到氧化还原反应物。
47.在本发明中，所述ph值优选为7。
48.本发明优选使用氢氧化钠调节所述ph值，本发明对所述氢氧化钠的用量没有特殊的限定，能够是所述ph值达到6～8即可。
49.本发明对所述氧化还原反应的温度和时间没有特殊的限定，在室温下进行即可。
50.得到氧化还原反应物后，本发明将所述氧化还原反应物进行离心，得到所述氧化钼量子点溶液。
51.在本发明中，所述离心的转速优选为10000rpm，时间优选为10分钟，所述离心得到的上清液即为所述氧化钼量子点溶液。
52.在本发明中，所述可溶性钴盐中钴离子与氧化钼量子点溶液的用量比优选为1mmol:2.5ml。
53.本发明优选将所述可溶性钴盐、可溶性锌盐和氧化钼量子点溶液混合后，再加入所述4,4'
‑
联苯甲酸。
54.所述水热反应完成后，本发明优选将所得水热反应产物依次进行离心、dmf洗涤、乙醇溶液洗涤和干燥，得到所述比率型荧光探针。
55.在本发明中，所述dmf洗涤、乙醇溶液洗涤的次数均优选为3次。
56.在本发明中，所述干燥的温度优选为70℃，时间优选为12小时。
57.本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制得的比率型荧光探针，包括co/zn
‑
mofs和氧化钼量子点，所述氧化钼量子点负载在所述co/zn
‑
mofs的表面，所述比率型荧光探针具有绣球花状结构。
58.图1为moo
x qds@co/zn
‑
mofs探针检测h2o2原理图。
59.本发明还提供了上述技术方案所述的比率型荧光探针在检测过氧化氢中的应用。
60.在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：
61.在黑暗条件下，将所述比率型荧光探针与邻苯二氨溶液混合，得到混合液；
62.将所述混合液与待测物混合后进行孵育，得到孵育物料；所述待测物中含有h2o2；
63.对所述孵育物料进行荧光检测，得到待测物的荧光强度；
64.以标准方程计算待测物中h2o2的含量，所述标准方程是以h2o2摩尔浓度为自变量、荧光强度为因变量的方程。
65.在本发明中，所述荧光检测的波长优选为330nm。
66.在本发明中，所述比率型荧光探针与邻苯二氨溶液中邻苯二氨的质量比优选为5:8。
67.在本发明中，所述比率型荧光探针优选以比率型荧光探针溶液的形式使用，所述比率型荧光探针溶液的浓度优选为0.5mg/ml。
68.在本发明中，所述邻苯二氨溶液的浓度优选为0.5mg/ml。
69.为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的比率型荧光探针及其制备方法和在检测过氧化氢中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
70.实施例1
71.荧光纳米探针moo
x qds@co/zn
‑
mofs的制备及表征：
72.(1)moo
x qds的制备：将20.0mg mos2纳米粉末与20ml h2o2溶液(30wt％h2o2溶液与h2o按照体积比2:3制得)混合，并在室温下搅拌该混合物2h，用氢氧化钠将混合物的ph值调节至7。最后，以10000rpm的转速离心10分钟，收集moo
x qds溶液。
73.(2)moo
x qds@co/zn
‑
mofs的制备：将1.0mmol硝酸钴(co(no3)2·
6h2o)，0.5mmol硝酸锌(zn(no3)2·
6h2o)和2.5ml moo
x qds溶液溶于20ml的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液中并搅拌5分钟，随后，将1.2mmol4,4'
‑
联苯甲酸加入到上述溶液中并搅拌30分钟。然后，将上述混合物转移到反应釜中并在120℃的烘箱中加热12小时。待水热反应完成，将上述产品离心后用dmf和乙醇溶液洗涤3次，并在70℃中干燥12小时得到moo
x qds@co/zn
‑
mofs荧光探针。
74.(3)对上述得到的moo
x qds、moo
x qds@co/zn
‑
mofs进行了tem、sem、xrd、ftir、xps表征，具体结果见图2～3。图2中(a)为moo
x qds的制备示意图，(b)为moo
x qds的tem图，(c)为moo
x qds@co/zn
‑
mofs的制备示意图，(d)为moo
x qds@co/zn
‑
mofs的sem图；图3中(a)为制得的材料的xrd，(b)制得的材料的ft
‑
ir图，(c)为moo
x qds@co/zn
‑
mofs的xps全谱图，(d)为co 2p分谱图，(e)为mo 3d分谱图，(f)为zn 2p分谱图；从图2的moo
x qds的tem图和moo
x qds@co/zn
‑
mofs的sem图可以看出两者成功制备；从图3的xrd、ftir及xps图可以看出moox qds成功修饰到co/zn
‑
mofs中。
75.荧光纳米探针moo
x qds@co/zn
‑
mofs用于h2o2检测：
76.(1)h2o2检测标准曲线的建立：将得到的500μl moo
x qds@co/zn
‑
mofs(0.5mg/ml)溶液与500μl邻苯二氨(0.8mg/ml)溶液混合，并在黑暗、常温环境下持续搅拌10分钟。将300μl不同浓度的h2o2标准溶液添加到上述混合物中，并孵育4分钟。然后，利用荧光光谱仪在330nm的激发波长下对上述混合物的荧光光谱进行测量并记录，根据荧光强度随h2o2浓度的变化关系建立定量模型用于h2o2浓度预测，并对该探针的选择性进行测试。具体结果见图4～5，图4中(a)为制得的探针在暴露于不同浓度h2o2下的荧光光谱图，(b)为制得的探针的响应信号随h2o2浓度变化关系图；图5中(a)为所制得的对干扰物的响应值(其中h2o2浓度为5.0μmol/l，干扰物浓度为50μmol/l)，插图为探针在干扰物存在下的荧光颜色变化，(b)为所制得的在暴露于5.0μmol/l h2o2和相同浓度干扰物下的荧光光谱。
77.从图4可以看出，所制备探针的检测范围为0.1nmol/l～100μmol/l，较低的检测限表明该探针对h2o2具有较高的灵敏度，这归因于moo
x qds@co/zn
‑
mofs的协同催化效应。
78.图5的结果表明该探针具有良好的选择性，这为其实际应用奠定了基础。
79.将探针置于4℃的冰箱里30天，探针荧光信号逐渐趋于平稳(见图6)，且其响应值仅比初始值降低了4.2％，表明该探针具有较好的稳定性。
80.(2)利用步骤(1)方法检测实际样品中h2o2：利用加标法对牛奶和湖水样品中h2o2进行检测。首先对实际样品进行预处理，以牛奶样品(5ml)为例，将相同体积的牛奶和去离子水进行混合，并加入2ml 10wt％的三氯乙酸溶液以沉淀牛奶中的蛋白质，然后将牛奶样品超声15分钟并在10000rpm下离心15分钟来移除蛋白质沉淀，收集上清液并用0.22μm的透析膜对其进行过滤，后将不同浓度的h2o2添加到上述上清液中，形成待测液。利用步骤(1)所建立的方法对待测液进行检测，并与实际添加浓度进行比较。具体结果见表1，回收率在97.4％～110.0％之间表明该探针可用于实际样品中的检测，具有较高的检测准确性。
81.表1检测实际样品中h2o2的检测结果
[0082][0083]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。