1.本发明涉及生物农药领域，尤其涉及一种生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球及其制备方法和应用。


背景技术：

2.苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)是世界上研究最多、应用最广、对人畜安全、不破坏生态平衡的微生物杀虫剂，在形成芽孢的过程中，能形成具有杀虫活性的伴胞晶体(parasporalcrystal)，伴孢晶体由具有高度特异的杀虫活性的一种或几种被称为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystalproteins，icps)或δ-内毒素(δ-endotoxins)的晶体蛋白组成。
3.虽然bt作为生物杀虫剂具有显著的优势，但由于bt的主要杀虫成分是杀虫晶体蛋白，抗紫外线和不良环境条件的能力较差，导致苏云金杆菌制剂存在持效期短，防治效果易受阳光、温度、雨水等外界气候和生态条件制约等缺点，其田间应用持效期短是制约该杀虫剂发展的瓶颈，如何提高其杀虫效果是相关研究机构和生产企业所共同面临的难题。
4.目前bt主要剂型包括粉剂、可湿性粉剂、悬浮剂、油剂、油乳剂、颗粒剂、片剂等剂型，但这些剂型均未完全解决以上问题。虽然bt微胶囊剂在国内外也有较多的研究，但主要是利用明胶、淀粉、纤维素、阿拉伯胶、聚γ-谷氨酸(γ-pga)等天然材料做壁材生产bt微胶囊剂，但仍然存在生物制剂的稳定性和环境适应性的问题。因此，现有的bt剂型还不能满足田间应用对其延长持效期、防治效果稳定、对紫外等外界条件耐受度高的要求，亟需对现有剂型进行改进。
5.生物炭是有机物质在低温缺氧条件下热解后的产品，主要由有芳香烃和单质炭或具有石墨结构的炭组成，含有60％以上的碳元素，其作为肥料缓释载体、土壤改良剂、污染物修复、减少碳排放量等方面近些年来受到国内外学者的广泛关注，生物炭孔隙度发达和比表面积巨大，可以作为优良的功能性微生物载体。目前已有研究利用生物炭固定降解菌实现持续降解环境污染物。而动物源生物炭是以动物骨粉为主要原料制备的生物炭，不但具有典型的植物源生物炭组分，还含有大量含氮基团和无机矿物成分羟基磷灰石，将其制备成纳米生物炭后，其分散能力、吸附能力和固定能力都有很大提高。
6.本发明针对目前bt菌制剂的缺点，通过引入动物源纳米生物炭吸附固定苏云金芽孢杆菌，利用海藻酸钠、壳聚糖等天然高分子材料进一步包埋和覆膜制备了生物炭基苏云金芽孢杆菌微球，改善了bt生物农药制剂的抗紫外线性能，提高了防治效果，为bt菌剂的应用推广奠定基础。


技术实现要素：

7.针对目前传统苏云金芽孢杆菌制剂的药效不稳定性、环境适应性差的问题，本发明提供了一种生物炭基苏云金芽孢杆菌微球及其制备方法和应用，该微球是以苏云金芽孢杆菌为模型药物，通过在海藻酸钠、壳聚糖等天然高分子制备的载体体系中引入高吸附的
纳米生物炭以固定苏云金芽孢杆菌及杀虫晶体蛋白，提高其抗紫外性能和药效稳定性。
8.为解决上述问题，本技术提供的方案具体如下：
9.第一方面，本技术还提供一种生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球的制备方法，其包括以下步骤：
10.(1)将生物炭与苏云金芽孢杆菌原粉加入经灭菌的蒸馏水中，经摇床振摇2～3h，进行静置、离心分离后，对离心获得的沉淀进行常温真空干燥、粉碎后得到吸附固定有苏云金芽孢杆菌的生物炭粉；其中，生物炭和苏云金芽孢杆菌总质量浓度为30～100g/l；
11.(2)将吸附固定有苏云金芽孢杆菌的生物炭粉与浓度为10～30g/l的海藻酸钠溶液混合均匀后，得到药物混合悬浮液；
12.(3)将得到的药物混合悬浮液滴加到浓度为10～40g/l的氯化钙溶液中，交联固化2-3h，过滤、分离，得到生物炭基苏云金芽孢杆菌/海藻酸钠微球；
13.(4)将得到的苏云金芽孢杆菌/海藻酸钠微球转移到浓度为1～10g/l的壳聚糖醋酸溶液中覆膜，过滤、分离、洗涤，再经过常温真空干燥后，得到生物炭基苏云金芽孢杆菌微球。优选地，覆膜时间为0.5～1h。
14.优选地，步骤(2)中，药物混合悬浮液中结合有苏云金芽孢杆菌的生物炭与海藻酸钠质量比为1:(3～7.5)。
15.优选地，交联剂为氯化钙；壳聚糖作为覆膜剂；进一步优选地，所述覆膜剂为壳聚糖醋酸溶液。
16.可选地，所述苏云金芽孢杆菌为苏云金芽孢杆菌菌株b-y7-1，其它实施例中可采用其他苏云金芽孢杆菌。
17.优选地，所述生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球中，苏云金芽孢杆菌原粉包括芽孢及杀虫晶体蛋白。
18.优选地，所述生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球中，吸附固定剂生物炭是以动物骨粉为原料制备的纳米生物炭。进一步优选地，所述吸附固定剂生物炭是以动物骨粉作为原料在缺氧条件下500℃炭化2h后，再经球磨机研磨12h获得。
19.可选地，生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球中，所述生物炭与苏云金芽孢杆菌原粉的质量比为1:1～3:1。优选地，所述生物炭与苏云金芽孢杆菌原粉的质量比为2:1，此条件下制备得到的生物炭基苏云金芽孢杆菌微球的各方面性能都更优异。
20.第二方面，本发明提供了一种生物炭基苏云金芽孢杆菌微球，其主要由以下组分制成：苏云金芽孢杆菌原粉、生物炭、海藻酸钠、氯化钙和壳聚糖，采用前述的制备方法制备得到。
21.所述微球中，苏云金芽孢杆菌原粉作为活性成分，生物炭作为吸附固定剂，海藻酸钠与氯化钙交联钙化作为载体，通过壳聚糖覆膜制备形成的苏云金芽孢杆菌生物菌剂，可以显著提高苏云金芽孢杆菌微球的包埋率、苏云金芽孢杆菌的存活率、药效稳定性、环境适应性，从而有效延长其药效持效期。
22.经检测，上述制备得到的生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球的包埋率在85％以上，粒径大小在1.0～1.5mm，且其制备的生物菌剂的抗紫外性能得到了改善。
23.第三方面，本技术还提供上述生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球作为生物杀虫剂中的应用。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明的生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球的配方原料少，制备方法简单，药效稳定，持效期长，易于进行工业化生产和推广应用。该微球以新型环境友好的苏云金芽孢杆菌为模型药物，以动物源纳米生物炭作为吸附固定剂，海藻酸钠与氯化钙交联钙化作为载体，通过壳聚糖覆膜制备的生物菌剂，可以显著提高生物炭基苏云金芽孢杆菌微球的药效稳定性、环境适应性，并延长其药效持效期，而且该苏云金芽孢杆菌缓释微球符合绿色农业发展的要求，为环境友好型微生物农药的田间进一步推广应用和农业可持续发展奠定基础。
附图说明
26.图1为添加动物源生物炭(图a)和未添加生物炭制备的苏云金芽孢杆菌微球(图b)的外观图；
27.图2为添加动物源生物炭(图a)和未添加生物炭制备的苏云金芽孢杆菌微球的电镜图(图b)。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
29.实验材料：
30.动物源纳米生物炭：以市售的动物骨粉为原料，在炭化炉中经500℃碳化2h后，进一步用球磨机研磨12h获得。粒径为纳米级。
31.苏云金芽孢杆菌原粉：包括芽孢及杀虫晶体蛋白，含菌量为3
×
10
10
cfu/g，该苏云金芽孢杆菌是青岛农业大学植物医学院提供的苏云金芽孢杆菌菌株b-y7-1，其保藏编号：cctcc no.m2011267，已在申请号为201711256177.8的专利中被公开。
32.苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂(8000iu/毫克)，购自山东省青岛泰源科技发展有限公司。
33.实施例1
34.本实施例提供一种生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球，其制备方法为：
35.(1)将动物源纳米生物炭与苏云金芽孢杆菌原粉按照质量比为1:1加入到经灭菌的蒸馏水中，保持动物源纳米生物炭与苏云金芽孢杆菌原粉的总质量浓度为50g/l，充分混合，经摇床以160r/min振摇2h后静置、离心分离出生物炭层，经真空干燥、粉碎得到吸附固定苏云金芽孢杆菌及杀虫晶体蛋白的生物炭粉。
36.(2)将步骤(1)吸附固定苏云金芽孢杆菌的生物炭粉0.4g加入到100ml已配置好的30g/l的海藻酸钠溶液中，经剪切机低速剪切混合均匀，制备生物炭与海藻酸钠的悬浮液。
37.(3)将步骤(2)得到的悬浮液采用锐孔法匀速滴加到100ml配置好的10g/l的氯化钙溶液中，交联固化2h，经沉淀、过滤，分离出苏云金芽孢杆菌/海藻酸钠微球。
38.(4)将步骤(3)得到的苏云金芽孢杆菌/海藻酸钠微球转移到100ml配置好的1g/l的壳聚糖醋酸溶液中，轻微搅拌，覆膜0.5h，微球经过滤、分离、洗涤，通过真空干燥得到生物炭基苏云金芽孢杆菌微球产品。
39.实施例2
40.本实施例提供一种生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球，其制备方法为：
41.(1)将动物源纳米生物炭与苏云金芽孢杆菌原粉按照质量比为2:1加入到经灭菌的蒸馏水中，保持动物源纳米生物炭与苏云金芽孢杆菌原粉的质量浓度为50g/l，充分混合，经摇床以160r/min振摇2h后静置、离心分离出生物炭层，经真空干燥、粉碎得到吸附固定苏云金芽孢杆菌及杀虫晶体蛋白的生物炭粉。
42.(2)将步骤(1)吸附固定苏云金芽孢杆菌的生物炭粉0.6g加入到100ml已配置好的20g/l的海藻酸钠溶液中，经剪切机低速剪切混合均匀，制备生物炭与海藻酸钠的悬浮液。
43.(3)将步骤(2)得到的悬浮液采用锐孔法匀速滴加到100ml配置好的20g/l的氯化钙溶液中，交联固化2h，经沉淀、过滤，分离出苏云金芽孢杆菌/海藻酸钠微球。
44.(4)将步骤(3)得到的苏云金芽孢杆菌/海藻酸钠微球转移到100ml配置好的1g/l的壳聚糖醋酸溶液中，轻微搅拌，覆膜0.5h，微球经过滤、分离、洗涤，通过真空干燥得到生物炭基苏云金芽孢杆菌微球产品。
45.实施例3
46.本实施例提供一种生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球，采用的动物源纳米生物炭与苏云金芽孢杆菌的质量比例为3:1，其制备方法同实施例1。
47.对比例1
48.植物源生物炭制备：选用核桃壳为原料，粉碎后放入坩埚中压实，在马弗炉中以10℃/min升温速率加热至500℃后，恒温保持2h，冷却降温取出，用去离子水洗涤至中性，即为植物源生物炭，并进一步按照试实施例1制备植物源生物炭基苏云金芽孢杆菌微球。
49.对比例2
50.与实施例1相比，本对比例制备的苏云金芽孢杆菌微球的原料中省去生物炭这一成分，其他成分相同，制备方法也参见实施例1的内容进行制备。
51.实施例4生物炭基苏云金芽孢杆菌微球的性能表征和稳定性测定
52.1、实验方法及步骤
53.(1)微球包埋率(ee％)的测定方法：取原菌液1ml，稀释后在pca培养基计数培养，记作n0。取相同菌量制备的微球样品，加入适量灭菌处理的质量分数为3.8％的柠檬酸钠溶液中，超声10min，使微球破裂溶解，取清液至pca培养基中计数培养，记作n1。按照公式1计算包埋率。
[0054][0055]
(2)抗紫外性能测定方法：
[0056]
分别取相同含菌量的bt微球产品以及未处理的bt菌悬液，平铺于无菌培养皿中，于紫外灯(30w，20cm)下照30min。将经照射前后的各试验样品破壁处理，在pca培养基中稀释培养，记录菌落记数，计算存活率。
[0057]
(3)微球粒径测定方法
[0058]
随机取制备的微球50粒，分别用游标卡尺测量其粒径，取其平均值。
[0059]
2、实验结果及分析
[0060]
测定苏云金芽孢杆菌缓释微球相关性能指标见表1。
[0061]
表1生物炭基苏云金芽孢杆菌微球与bt菌剂的性能对比
[0062]
样品粒径(mm)包埋率(％)存活率(％)实施例11.5287.460.2实施例21.6491.364.7实施例31.7590.662.3对比例11.6684.351.8对比例21.4180.247.5bt菌液
‑‑
5.31
[0063]
由表1可知，生物炭添加后可以增大微球的粒径，其对苏云金芽孢杆菌的包埋率也有影响，其中实施例2的包埋率最高，达到91.3％，高于植物源生物炭和没有添加生物炭的微球。存活率结果表明，将苏云金芽孢杆菌微球化可以提高其抗紫外线能力，而且加入生物炭后可以进一步改善其抗紫外性能。经紫外照射处理后苏云金芽孢杆菌的存活率显示，动物源生物炭要优于植物源生物炭和未添加生物炭的微球，其中实施例2的存活率最高，达到64.7％。
[0064]
实施例5生物炭基苏云金芽孢杆菌缓释微球的药效实验
[0065]
1、实验方法及步骤
[0066]
①
将实施例2制备的生物炭基苏云金芽孢杆菌微球在田间对蛴螬进行了药效试验，同时以市售的苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂作为对照药剂，进行对照试验。具体实验方法如下：
[0067]
实验田选择山东省平度市花生田。土壤为沙壤土，肥力中等，在花生播种前分别用本发明制备的生物炭基苏云金芽孢杆菌微球(实施例2制备)、苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂进行土壤处理，药剂用量为3000g/hm2。
[0068]
②
调查方法参照gb/t17980.72-2004《农药田间药效试验准则(二)第72部分：杀虫剂防治旱地地下害虫》进行，共进行3次虫口调查，分别于药后10d，20d，40d各调查1次。每小区“z”字形5点取样，每点50cm
×
50cm(0.25m2)，挖土深度为30cm左右。试验过程中注意观察施药后花生是否出现失绿、萎蔫等现象，如无上述症状则表明无药害现象发生，试验结果见表2。
[0069]
表2 b-y7-1缓释微球防治花生蛴螬田间药效实验效果
[0070][0071]
2、实验结果及分析
[0072]
表1的结果表明，相对于现有的bt可湿性粉剂，本技术的苏云金芽孢杆菌缓释微球具有更好的持效性，药后40d平均防治效果达到85.72％，且并对花生安全。
[0073]
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。