1.本发明涉及一种显微成像装置及方法，具体涉及一种基于色散元件的多角度全内反射照明成像装置，无需进行入射角度调节即可实现多角度全内反射照明，可用于活体细胞细胞膜附近生命活动的三维超分辨成像研究。


背景技术：

2.在传统的多角度全内反射照明成像装置中，每次成像只能实现单个角度照明，多角度照明的实现需要通过调节振镜进行扫描，这样牺牲了时间分辨力，不利于对于无标记生物样品的动态成像。
3.因此，如何提供一种无需进行入射角度调节即可实现多角度全内反射照明的装置是本领域技术人员急需解决的技术问题。


技术实现要素：

4.在下文中给出了关于本发明的简要概述，以便提供关于本发明的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本发明的穷举性概述。它并不是意图确定本发明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
5.鉴于此，为了克服上述技术问题，本发明提供了一种基于色散元件的多角度全内反射照明成像装置，不需要入射角调节即可实现多角度全内反射照明成像。
6.基于色散元件的多角度全内反射照明成像装置，包括照明分光模块、物镜型tir模块和成像分光模块；
7.所述照明分光模块按照光线传播方向依次为：led宽谱准直光源、平面反射式光栅和消色差透镜一；
8.所述led宽谱准直光源发出宽光谱准直光束，通过所述平面反射式光栅和所述消色差透镜一被分光为a、b、c三个波长的聚焦光，聚焦在高数值孔径浸油物镜后焦面上；
9.所述物镜型tir模块按照光线传播方向依次为：高数值孔径浸油物镜后焦面和高数值孔径浸油物镜；
10.所述高数值孔径浸油物镜后焦面作为照明分光模块的光束聚焦平面，聚焦在高数值孔径浸油物镜后焦面的光束入射至所述高数值孔径浸油物镜，在高数值孔径浸油物镜出射端面形成tir照明；
11.所述成像分光模块按照光线传播方向依次为：成像物镜、平面反射镜、消色差透镜二、凹面衍射光栅和相机；
12.所述成像物镜收集tir照明下样品的散射光，收集的散射光入射所述的成像物镜后出射为平行光束，平行光束在经过所述的平面反射镜调整光路方向后入射至所述消色差透镜二，将散射光聚焦在所述的凹面衍射光栅物面上，光束经过凹面衍射光栅后聚焦在所述相机上。
13.优选的，所述平面反射式光栅只有一级衍射条纹进入物镜型tir模块，一级衍射条纹不同波长分光角度表达式为：
[0014][0015]
其中，为led宽谱准直光源发出的光进入平面反射式光栅的入射角度，d为平面反射式光栅的光栅常数，λ代表入射光波长，φ(λ)为分光角度；
[0016]
优选的，所述消色差透镜一焦面和所述高数值孔径浸油物镜后焦面重合。
[0017]
优选的，所有波长的照明光束a、b、c入射至所述高数值孔径油浸物镜后出射光与光学系统主光轴夹角大于全内反射临界角：
[0018][0019]
其中，n
oil
为镜油折射率，n
sam
为样品折射率，θc为全内反射临界角。
[0020]
优选的，全内反射入射角度θ与高数值孔径浸油物镜后焦面光斑径向距离r满足：
[0021][0022]
其中，f5为高数值孔径浸油物镜焦距。
[0023]
优选的，消色差透镜一的焦距为f3，高数值孔径浸油物镜焦距为f5，则
[0024][0025][0026]
其中δ(λ)为随波长变化的全内反射穿透深度，n
air
为空气折射率，n
oil
为镜油折射率，n
sam
为样品折射率,为led宽谱准直光源发出的光进入平面反射式光栅的入射角度，d为平面反射式光栅的光栅常数，λ表示入射全内反射介质界面时光的波长，经过分光后不同波长的光对应不同的穿透深度。
[0027]
优选的，样品发生弹性散射，且散射光与入射光波长相同。
[0028]
优选的，所述消色差透镜二后焦面与所述凹面衍射光栅工作面重合。
[0029]
有益效果：
[0030]
第一、对观测生命体无除光照外，例如染色等干预，可以更加真实观测样品动态。
[0031]
第二、成像速度快，不需要进行入射角扫描。
[0032]
第三、穿透深度可调，三维成像分辨力高。
附图说明
[0033]
图1为本发明的基于色散元件的多角度全内反射照明成像装置的结构示意图。
[0034]
图中：1 led宽谱准直光源、2平面反射式光栅、3消色差透镜一、4高数值孔径浸油
物镜后焦面、5高数值孔径浸油物镜、6样品、7成像物镜、8平面反射镜、9消色差透镜二、10凹面衍射光栅、11相机。
具体实施方式
[0035]
在下文中将结合附图对本发明的示范性实施例进行描述。为了清楚和简明起见，在说明书中并未描述实际实施方式的所有特征。然而，应该了解，在开发任何这种实际实施例的过程中必须做出很多特定于实施方式的决定，以便实现开发人员的具体目标，例如，符合与系统及业务相关的那些限制条件，并且这些限制条件可能会随着实施方式的不同而有所改变。此外，还应该了解，虽然开发工作有可能是非常复杂和费时的，但对得益于本发明公开内容的本领域技术人员来说，这种开发工作仅仅是例行的任务。
[0036]
在此，还需要说明的一点是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的装置结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
[0037]
如附图1所示，本实施例提供了一种基于色散元件的多角度全内反射照明成像装置，用于方便装调和后续移动观测目标。
[0038]
一种基于色散元件的多角度全内反射照明成像装置，包括照明分光模块、物镜型tir模块、成像分光模块；
[0039]
照明分光模块按照光线传播方向依次为：led宽谱准直光源1、平面反射式光栅2、消色差透镜一3；
[0040]
led宽谱准直光源1发出宽光谱准直光束，通过平面反射式光栅2和消色差透镜一3被分光为a、b、c三个波长的聚焦光，聚焦在高数值孔径浸油物镜后焦面4上；
[0041]
物镜型tir模块按照光线传播方向依次为：高数值孔径浸油物镜后焦面4、高数值孔径浸油物镜5；
[0042]
高数值孔径浸油物镜后焦面4作为照明分光模块的光束聚焦平面，聚焦在高数值孔径浸油物镜后焦面4的光束入射至高数值孔径浸油物镜5，在高数值孔径浸油物镜5出射端面形成tir照明；
[0043]
成像分光模块按照光线传播方向依次为：成像物镜7、平面反射镜8、消色差透镜二9、凹面衍射光栅10、相机11；
[0044]
成像物镜7收集tir照明下样品6的散射光，收集的散射光入射成像物镜7后出射为平行光束，平行光束在经过平面反射镜8调整光路方向后入射至消色差透镜二9，将散射光聚焦在凹面衍射光栅10物面上，光束经过凹面衍射光栅10后聚焦在相机11上。
[0045]
更为具体地：平面反射式光栅2具有光栅常数d，且只有一级衍射条纹进入物镜型tir模块，一级衍射条纹不同波长分光角度表达式为其中为led宽谱准直光源发出的光进入平面反射式光栅的入射角度，λ代表入射光波长，φ(λ)为分光角度，d为平面反射式光栅的光栅常数；
[0046]
更为具体地：消色差透镜一3焦面与高数值孔径油浸物镜5后焦面4重合；
[0047]
更为具体地：(a)(b)(c)平行光入射高数值孔径油浸物镜5后出射光与光学系统主
光轴夹角应大于全内反射临界角其中，n
oil
为镜油折射率，n
sam
为样品折射率，θc为全内反射的临界角度；
[0048]
更为具体地：全内反射入射角度θ与高数值孔径浸油物镜后焦面4光斑径向距离r满足
[0049]
更为具体地：令f3为消色差透镜一3的焦距，f5为高数值孔径浸油物镜5焦距，则其中δ(λ)为随波长变化的全内反射穿透深度，n
air
为空气折射率，n
oil
为镜油折射率，n
sam
为样品折射率,为led宽谱准直光源发出的光进入平面反射式光栅的入射角度，d为平面反射式光栅的光栅常数。
[0050]
更为具体地：全内反射穿透深度仅与照明波长λ有关；
[0051]
更为具体地：样品6主要发生弹性散射，散射光与入射光波长相同；
[0052]
更为具体地：消色差透镜二9后焦面与凹面衍射光栅10工作面重合；
[0053]
更为具体地：散射光经过凹面衍射光栅10分光后不同波长的散射光聚焦到相机11像面不同位置，每个位置的成像结果对应一个穿透深度的照明成像结果。
[0054]
本发明利用反射式色散元件对宽光谱平行光束进行分光，不同波长平行光在消色差透镜作用下聚焦到高数值孔径浸油物镜后焦面不同位置，可以得到穿透深度随波长变化的倏逝场，实现穿透深度的调控。在成像光路中，该发明加入了凹面衍射光栅单独提取不同的穿透深度照明下的成像结果，实现多角度全内反射成像。该发明为多角度全内反射成像装置，相比于传统的物镜型多角度全内反射成像装置，该方法成像速度快，并且能够在全内反射成像的同时进行散射光谱分析。
[0055]
虽然本发明所揭示的实施方式如上，但其内容只是为了便于理解本发明的技术方案而采用的实施方式，并非用于限定本发明。任何本发明所属技术领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭示的核心技术方案的前提下，可以在实施的形式和细节上做任何修改与变化，但本发明所限定的保护范围，仍须以所附的权利要求书限定的范围为准。