1.本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及一种蛋白基发泡剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.表面活性剂对泡沫、乳液等界面主导食品体系的形成与稳定性起关键作用。食源性蛋白是天然表面活性物质，作为最具潜力的替代品受到了广泛关注。乳蛋白因其具有极高营养价值和多种功能特性等优点，在调控界面主导的食品体系稳定性领域极具应用前景，但其由于泡沫稳定性差而限制了其在食品中的应用。添加小分子表面活性剂是一种提高乳蛋白泡沫性的优选技术。
3.α-乳白蛋白具有多样化的功能特性，通常可以作为泡沫剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂等广泛用于食品加工，但是其作为泡沫剂时，起泡能力和泡沫稳定性并不好，虽然目前也有向其中加入表面活性剂来调整其发泡性能的研究，但是其发泡性能并未得到较大程度的改善，其起泡能力和泡沫稳定性依然没有得到显著提升。


技术实现要素：

4.为克服现有技术的上述问题，本发明提供了一种蛋白基发泡剂及其制备方法和应用。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明提供了一种蛋白基发泡剂，原料包括乳白蛋白和甘草酸，所述蛋白基发泡剂中，乳白蛋白与甘草酸的摩尔浓度比为1∶(2.5～750)。
7.优选的，所述蛋白基发泡剂中，乳白蛋白的浓度为20μm。
8.本发明还提供了一种上述蛋白基发泡剂的制备方法，包括以下步骤：配制乳白蛋白溶液并调整ph，之后加入甘草酸反应即得所述蛋白基发泡剂。
9.甘草酸作为一种功能性植物三萜皂苷，由于其具有多种生理功能，如降低血糖、调节肠道微生物菌群等，常被用作一种增稠剂和代糖等应用在食品中。
10.优选的，所述调整ph为2.5～7.0。
11.进一步优选的，所述调整ph为2.5。
12.经ph处理后的乳白蛋白，二级和三级结构发生变化，促进蛋白质分子的展开，增加了与小分子表面活性剂结合的可能。
13.优选的，所述调整ph后还包括对乳白蛋白溶液静置10～15h的操作。
14.优选的，所述反应在室温下进行，时间为20～40min。
15.本发明还提供了上述蛋白基发泡剂在发泡食品中的应用。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.本发明通过对乳白蛋白溶液的ph进行调整，使乳白蛋白二级和三级结构发生变化，促进蛋白质分子的展开，增加了与小分子表面活性剂结合的可能，与甘草酸进行复合之
后，极大的改善了乳白蛋白的泡沫性及泡沫稳定性等特性；与未添加甘草酸的乳白蛋白相比，本发明制备得到的含有甘草酸的乳白蛋白基发泡剂的泡沫性和泡沫稳定性最高可提高382.93％和65.96％；本发明制备得到的蛋白基发泡剂具有良好的发泡效果，适于在发泡食品中添加使用。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为乳白蛋白的存在对甘草酸聚集程度的影响图；
20.图2为不同ph条件对甘草酸结合乳白蛋白分子数的影响图；
21.图3为不同甘草酸添加比例对乳白蛋白表面疏水性的影响结果图；
22.图4为不同甘草酸添加比例对乳白蛋白浊度的影响结果图；
23.图5为不同甘草酸添加比例对乳白蛋白静态流变性的影响结果图，图5中(a)和(b)分别为实施例1、实施例2中不同甘草酸添加比例制备得到的发泡剂的静态流变特性测定结果；
24.图6为不同甘草酸添加比例对乳白蛋白动态流变性的影响结果图，图6中(a)和(b)分别为实施例1、实施例2中不同甘草酸添加比例制备得到的发泡剂的动态流变特性测定结果；
25.图7为不同甘草酸添加比例对乳白蛋白泡沫性和泡沫稳定性的影响结果图，图7中(a)为不同甘草酸添加比例的发泡剂的起泡能力计算结果，(b)为不同甘草酸添加比例的发泡剂的泡沫稳定性计算结果；
26.图8为不同甘草酸添加比例对乳白蛋白泡沫微观结构的影响结果图，图8中(a)为ph7.0的乳白蛋白及添加不同比例的甘草酸的乳白蛋白/甘草酸的泡沫微观结构图；(b)为ph2.5的乳白蛋白及添加不同比例的甘草酸的乳白蛋白/甘草酸的泡沫微观结构图；(c)为ph7.0的不同浓度的单独甘草酸泡沫微观结构图；(d)为ph2.5的不同浓度的单独甘草酸泡沫微观结构图；
27.图9中(i)和(ii)分别为实施例1和实施例2制备的不同甘草酸添加比例的发泡剂的泡沫界面形貌图，图中(a)～(b)为甘草酸的浓度0mm时不同放大倍数下的气泡的界面形貌图，(c)～(d)为甘草酸的浓度3mm时不同放大倍数下的气泡的界面形貌图，(e)～(f)为甘草酸的浓度10mm时不同放大倍数下的气泡的界面形貌图。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
29.另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围
内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
30.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
31.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
32.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
33.以下实施例中，所采用的乳白蛋白(α-la)购自davisco公司，甘草酸(ga)购自上海源叶试剂有限公司。
34.实施例1
35.蛋白基发泡剂的制备，包括以下步骤：
36.用磷酸盐缓冲液(pbs，10mmol/l，ph 7.0)配制得到浓度为20μm的乳白蛋白溶液，连续搅拌3h，采用氢氧化钠溶液调节其ph为7，放置12h；向其中分别加入不同量的甘草酸，使得溶液中甘草酸的浓度分别为：0mm、0.5mm、1.0mm、3.0mm、10.0mm和15.0mm，混合搅拌均匀，室温下反应30min得到混合液，即蛋白基发泡剂。
37.实施例2
38.蛋白基发泡剂的制备，包括以下步骤：
39.用磷酸盐缓冲液(pbs，10mmol/l，ph 7.0)配制得到浓度为20μm的乳白蛋白溶液，连续搅拌3h，调节其ph为2.5，放置12h；向其中分别加入不同量的甘草酸，使得溶液中甘草酸的浓度分别为：0mm、0.5mm、1.0mm、3.0mm、10.0mm和15.0mm，混合搅拌均匀，室温下反应30min得到混合液，即蛋白基发泡剂。
40.效果验证
41.1.乳白蛋白的存在对甘草酸聚集程度的影响
42.聚集程度的测定：将ans溶液(80μl，8mmol/l)加入到4ml实施例1和实施例2制备得到的混合溶液中，避光放置15min。使用1cm光路比色皿进行测量，仪器的激发/发射狭缝设置为5.0/2.5nm。激发波长设为355nm，发射光谱记录为360～600nm。记录最荧光强度值。以f/f0为指标，研究在乳白蛋白存在条件下甘草酸的聚集程度，结果如图1所示。
43.在阐明α-la和ga相互作用的详细研究之前，有必要了解蛋白质如何影响ga分子的聚集。如图1所示，在ans存在下，α-la的固有荧光强度在中性和酸性溶液中随着ga浓度从0到15.00mm的增加而先降低后增加。荧光强度发生降低主要是因为ga分子与ans探针在α-la疏水区域发生了竞争性结合。荧光强度与荧光量子产率有关。在这项工作中，与α-la结合的ans的远低于在ga聚合体中的量子产率。因此，与ans结合蛋白质的在较高的ga浓度下增加，因为在聚集体中结合ans探针的远大于与蛋白质结合的ans的图1显示了ans的荧光强度降低是总ga浓度，而不是游离ga浓度。在蛋白质表面形成小分子聚集体所需
的阈值浓度称为临界聚集浓度(cac)，通常低于临界胶束浓度(cmc)。基于此，我们还发现在α-la存在的情况下，f/f0对ga的图中的断点(即cac)与ph条件不同。例如，α-la的荧光最小值在中性条件下在1.0mm ga存在下记录，而在酸性溶液中添加2.0mm ga后观察到最小值。由于ga原溶液的ph为4.3，当ph为2.5时，ga的羧酸盐被质子化，其静电荷被屏蔽，从而导致ga分子间的排斥力降低，促进其自组装形成聚集体。
44.2.不同ph条件对甘草酸结合乳白蛋白分子数的影响
45.甘草酸结合乳白蛋白分子数的测定：在25℃固定乳白蛋白浓度20μmol/l不变，改变甘草酸的浓度(0-15.0mm)，形成配制乳白蛋白-甘草酸混合溶液。通过对此混合溶液甘草酸色氨酸内源荧光(λex＝295nm)的测定，计算出每个蛋白质分子结合表面活性剂分子的平均数(ν)，由平均数随甘草酸总浓度的变化可得到结合等温线，如图2所示。
46.结合等温线可以很好地理解蛋白质-甘草酸的结合行为，以每个蛋白质分子结合的平均甘草酸分子数(v)为响应值作为判定标准。一般而言，结合等温线显示三个特征区域：(i)特异性结合，(ii)非协同结合和(iii)协同结合。从图2中可以看出，区域i包括ga浓度从0到0.20mm的区域。在该区域，结合等温线缓慢增加，这可能是由于ga和α-la之间的特异性结合。此外，我们还可以观察到，ph对该区域的α-la和ga的结合等温线没有显着影响。在0.02《c
ga
《1.00mm的区域ii中，结合ga分子的平均数v缓慢但明显增加，其中荧光强度的最大值降低。在1.00和15.00mm之间的区域iii中，随着蛋白质上聚集体的形成，出现了大量的协同结合。此外，区域ii和iii下，不同ph条件下的v值之间的区别很明显(见表1)。在非协同结合和协同结合过程中，酸性条件可以诱导更多的ga分子与α-la结合。这可能是酸性条件可以展开α-la结构，促使更多的疏水基团暴露，从而使得α-la与更多ga分子结合。
47.表1
[0048][0049]
3.不同甘草酸添加比例对乳白蛋白表面疏水性的影响
[0050]
乳白蛋白表面疏水性的测定：将实施例1～2制备得到的蛋白基发泡剂样品用磷酸盐缓冲液(ph 7.0，浓度为0.01mol/l)稀释到0.2-1.0mg/ml，取20μl ans溶液(浓度为8mmol/l)加入到4ml的稀释蛋白样品中，振荡混合并在暗处反应15min。设定激发波长为390nm，发射波长为470nm，狭缝宽度为5nm。测得的荧光强度作为纵坐标、蛋白浓度为横坐标，进行线性回归分析，得到的初始斜率作为蛋白样品的表面疏水性。所得结果如表2及图3所示。
[0051]
表2
[0052][0053]
由表2和图3可以看出，ga的加入使得α-la的表面疏水性增加(p《0.05)。这可能是由于引入了ga的疏水基团，从而降低了α-la/ga复合物中周围溶液的极性。随着ga浓度的增加，它对α-la表面疏水性的影响更加显著(p《0.05)。
[0054]
4.不同甘草酸添加比例对乳白蛋白浊度的影响
[0055]
发泡剂浊度的测定：取50μl实施例1和实施例2新制备得到的混合液加入到5m l体积分数0.1％的sds中充分混匀，在500nm下测定吸光值为a
500
，即溶液的浊度，结果如表3和图4所示。
[0056]
表3
[0057][0058][0059]
由表3和图4可知，在乳白蛋白溶液为中性条件下，在ga浓度为0-3.00mm范围内样品的浊度保持不变，而在10.00mm ga的存在下显着增加，与单独的α-la相比增加了160.45％(p《0.05)。这种现象伴随着溶液颜色和透明度的变化。在这种情况下，溶液中存在的ga分子除了与α-la结合外都是聚集体。而乳白蛋白溶液的ph为2.5时，对复合物的浊度影响更大，如ga浓度为15.0mm时，乳白蛋白溶液的ph为7.0时浊度增加437.15％，而在ph 2.5时观察到浊度增加1925.57％(p《0.05)。这表明酸性溶液中存在较高的聚集度。在这种情况下，尤其是添加了15.0mm ga时，复合溶液为白色不透。即：在酸性溶液下，α-la和ga的结合相互作用比在中性条件下强；同时，在酸性溶液下，ga的羧酸盐被质子化，其静电荷被屏蔽，从而降低了ga分子之间的排斥力，促进了其自组装形成更多的聚集体。
[0060]
5.不同甘草酸添加比例对乳白蛋白静态流变性的影响
[0061]
发泡剂静态流变特性的测定：使用rst流变仪对实施例1～2制备得到的不同甘草酸添加比例的混合液进行流变学的测定。测定过程中温度控制在25℃，剪切速率范围为0.1-100s-1
，记录剪切应力和表观粘度的数值。结果如图5所示，其中(a)与(b)分别为实施例1、实施例2制备得到的发泡剂的静态流变特性测定结果。图5显示了α-la/ga复合物在不同ph值下的表观粘度结果。在0-1.00mm ga存在下测量了单独的α-la和结合α-la的表观粘度，但没有数据，这可能是溶液的粘度较低。然而，添加3.00mm ga以上时，结合的α-la的表观粘度随着剪切速率的增加而降低，表明α-la/ga复合物在ph 7.0和ph 2.5时表现出温和的剪切稀化行为。此外，在相同的ga浓度下，复合物ph 2.5时的表观粘度高于ph 7.0。酸性条件可以促进ga分子的随机聚集，与中性条件相比，这可以产生更大的流动阻力。
[0062]
6.不同甘草酸添加比例对乳白蛋白动态流变性的影响
[0063]
发泡剂动态流变特性的测定：使用rst流变仪对实施例1～2制备得到的不同甘草酸添加比例的混合液进行流变学的测定。测定过程中温度控制在25℃，样品动态模量的频率在0.01到10hz范围内，扫描的恒定应变幅度为0.3％。
[0064]
实施例1～2制备得到的α-la/ga混合液的动态流变结果分别如图6(a)和(b)所示。在0.01-10hz的频率范围内，对于酸性和中性条件，配合物的g'始终高于g”，它们之间没有交叉，表明所有样品中都存在较弱的凝胶网络结构。此外，所有样本的g'和g”值都表现出对频率的依赖性，这表明g'和g”随着频率值的增加而增加。在ph 7.0和ph 2.5下，α-la在15.0mm ga存在下的g'和g”值显着高于其他ga浓度(p《0.05)，这与粘度结果一致。
[0065]
7.不同甘草酸添加比例对乳白蛋白泡沫性和泡沫稳定性的影响结果图
[0066]
发泡剂泡沫性和泡沫稳定性测定：分别将15ml实施例1～2制备得到的样品溶液(v)加入到100ml体积的量筒中，然后使用高速乳化机进行均质乳化(10000rpm均质2min)。均质结束后，立即在0min记录泡沫的体积(v0)。将混合物静置30min后，记录泡沫的体积(v
30
)。使用以下公式计算起泡能力(fa)和泡沫稳定性(fs)：
[0067][0068][0069]
起泡能力计算结果如表4、图7(a)所示，泡沫稳定性计算结果如表5、图7(b)所示。
[0070]
表4
[0071][0072]
表5
[0073][0074]
从表4～5及图7(a)～(b)中可以看出，随着甘草酸添加比例的增加，蛋白的起泡能力和泡沫稳定性都呈现上升的趋势。当甘草酸添加量为10.0mm时，酸性预处理乳白蛋白起泡能力和泡沫稳定性最大，分别为42.19％、78.06％；与未添加甘草酸的酸性乳白蛋白相比，起泡能力和泡沫稳定性分别增加了382.93％、65.96％。说明甘草酸的添加有利于改善蛋白的起泡特性。另外，在没有添加甘草酸时，经过酸性预处理的蛋白具有比中性处理的蛋白更高的起泡能力和泡沫稳定性，分别增加了133.74％和59.26％。经过酸性处理的蛋白质
分子可以更快的扩散吸附到气-液界面，达到界面后，可迅速伸展和重排，并且通过分子之间的相互作用形成具有强内聚力和黏弹性的吸附膜，从而增加其起泡特性。
[0075]
8.不同甘草酸添加比例对乳白蛋白泡沫微观结构的影响
[0076]
发泡剂微观结构观察：使用光学显微镜观察实施例1～2所制备的不同发泡剂样品的微观结构，结果如图8所示，其中(a)为ph7.0的乳白蛋白及添加浓度分别为1.0mm、10.0mm及15.0mm的甘草酸的乳白蛋白/甘草酸的泡沫微观结构图；(b)为ph2.5的乳白蛋白及添加浓度分别为1.0mm、10.0mm及15.0mm的甘草酸的乳白蛋白/甘草酸的泡沫微观结构图；(c)为ph7.0的浓度分别为3.0mm、10.0mm及15.0mm的单独甘草酸泡沫微观结构图；(d)ph2.5的浓度分别为3.0mm、10.0mm及15.0mm的单独甘草酸泡沫微观结构图。
[0077]
由图8可知，在ph 7.0和ph 2.5时，单独α-la的气泡大小随时间延长而增大。与ph 7.0相比，ph 2.5的变化导致单独α-la的剩余气泡大小在30分钟的衰减时间内减小较少。这通常可以通过其表面电荷的增加来解释，从而基于蛋白质-蛋白质分子间相互作用的改善促进空气/水界面的吸收。在ga存在下，α-la/ga复合物能够产生尺寸分布更窄的尺寸减小的气泡。此外，较高的ga浓度对α-la形成的气泡大小有更显着的影响。气泡直径越小，泡沫稳定性越好。这表明较高的ga浓度可以使α-la溶液产生更稳定的气泡。在ph 2.5下，单独α-la和与ga结合的α-l在ph 7.0的比较中进一步形成了较小尺寸的气泡，这也证实了ph 2.5下的泡沫在长期储存中表现出高稳定性，这在发泡食品加工中有很好的应用潜力。
[0078]
9.不同甘草酸添加比例对乳白蛋白泡沫界面形态的影响
[0079]
发泡剂泡沫界面形态观察：通过冷冻扫描电镜观察和分析实施例1～2制备得到的不同发泡剂样品稳定的新鲜泡沫。将少量新鲜泡沫固定在铜架上，然后将样品迅速放入液氮(-208℃)中进行冷冻处理。在扫描电子显微镜仪器上观察冷冻泡沫的微观结构，结果分别如图9(i)和(ii)所示所示。图9(i)和(ii)中，(a)和(b)为甘草酸的浓度0mm、(c)和(d)为甘草酸的浓度3mm、(e)和(f)为甘草酸的浓度10.0mm时的气泡的界面形貌，其中(a)、(c)及(e)的放大倍数均为600倍，(b)、(d)及(f)的放大倍数均为20k倍。
[0080]
图9记录了由单独α-la和与ga结合的α-la形成的气泡的界面形貌。测试样品稳定的气泡表面膜显示出足够光滑和均匀，这表明蛋白质分子固定在空气/水界面上。与ph 7.0(图9(i))相比，ph 2.5(图9(ii))可以在泡沫周围为单独α-la构建更厚的膜层，这可以避免气泡聚结，从而稳定气泡。我们推测α-la在酸性溶液中较高的表面疏水性可以抑制泡沫歧化，从而形成更细腻的泡沫而不会迅速塌陷。与单独的α-la相比，如图9(i)中的(d)和(f)和图9(ii)中的(d)和(f)所示，α-la/ga复合物泡沫周围有更厚的界面层，这可以防止聚结并使气泡之间的空气扩散低。这种现象可能归因于α-la和ga在酸性溶液中的空气/水界面处的强吸附，可以防止气泡之间的歧化和聚结，从而保持泡沫的稳定性。
[0081]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。