1.本发明是一种保留原始香气的块菌电子束辐照工艺及产品，具体涉及一种基于电子束辐照来保留原始香气的块菌保鲜工艺及其制备得到的块菌产品，属于食用菌保鲜技术领域。


背景技术：

2.块菌，也称松露，具有独特的香味、口感和营养价值。其中，四川地区的印度块菌品质可与欧洲的黑孢块菌相媲美，价格又低于欧洲的黑孢块菌和夏块菌，因此，深受国际市场的青睐，远销国内外。块菌香气迷人，营养丰富，但采收后因酶解作用加强以及微生物腐败作用旺盛，容易导致组织软化、产生异味等现象，破坏了块菌特有的香气特征，失去再加工和食用价值。现有块菌保鲜技术，如低温保存、冷冻干燥和化学消毒虽然可以有效延长块菌的保质期，但是这些处理方法都会改变块菌特有的质构和香气。因此，目前块菌采收后因无其它有效的保鲜手段，常常会因为没有进行及时有效的保鲜处理而劣变，失去商品价值。
3.电子束辐照是一种安全有效、绿色环保的保鲜方法，利用β射线（高速运动的电子流）使果蔬表面的水、蛋白等化学物质发生电离，形成自由基，有效的杀灭果蔬表面的虫卵和微生物，从而实现高效保鲜。相较于γ-辐照，电子束辐照无放射性核泄漏的安全隐患，节能环保，绿色无污染。近年来，随着电子束辐照的功率和穿透力提高，应用于食用菌保鲜的研究取得了很多进展。
4.例如：公开号为cn102524757a的发明专利公开的食用菌co2包装低温低剂量辐照保鲜方法。将食用菌用薄膜去气后充入co2进行包装，再将包装好的食用菌预冷、5-10mev电子束射线进行辐照，辐照吸收剂量0.1-1.0kgy，辐照剂量均匀度＜1.25，在常温（10-25℃）下可保持食用菌原色、香、味、态4天，贮藏在0-4℃下可保鲜14天。
5.又如：公开号为cn208434618u的实用新型专利还公开了一种利用电子辐照食用菌保鲜装置。通过将食用菌送至芸苔素内脂溶液箱中浸泡3-5min后，再用风干装置进行低温风干处理后，送入包装袋装置进行包装处理，食用菌包装后运输到气体装置，将包装袋内的气体抽空并充入一定比例的一氧化氮、二氧化氮及氮气，以抑制食用菌的呼吸频率，进一步延长食用菌的保鲜期，最后送入辐照装置，在10mev的电子加速器频率下进行杀菌消毒处理，放在细菌等有害病菌对食用菌质量造成污染。
6.基于上述内容，现有食用菌的保鲜技术虽然也采用电子束辐照工艺，但其重点在于通过抑制食用菌的呼吸来抑制食用菌有害微生物的繁殖，从而实现食用菌的保鲜。但为提高块菌的商品价值，除抑制块菌的呼吸强度外，如何利用电子束辐照工艺维持块菌的特定质构和其特有的香气特征才是当前块菌保鲜技术的重点。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种保留原始香气的块菌电子束辐照工艺，将采收后的块菌经浸渍淘洗、风干、真空包装和1.5kgy电子束辐照的工艺步骤进行保鲜处理，处理步骤简
单，能有效维持块菌特有的原始香气，并延长块菌货架期。
8.本发明的另一目的在于提供一种保留原始香气的块菌产品，其重点在于通过电子辐照工艺解决块菌的保鲜，以延长其货架期，同时还能保留块菌特有的原始香气。
9.本发明通过下述技术方案实现：一种保留原始香气的块菌电子束辐照工艺，包括以下步骤：s1.将块菌采收后于24h内采用20℃以下的盐水进行浸渍淘洗和过滤，所述的盐水浓度为25-30%，浸渍时间为30-50分钟；s2.将清洗过滤后的块菌通过环流风干设备进行三次风干，所述的环流风干设备是指采用环形出风管道对块菌的四周形成均匀风干，所述的第一次风干设备控制温度范围30-40℃
°
，第二次风干设备温度范围50-60℃，第三次风干设备温度范围为70℃； s3.对均匀风干后的块菌进行真空包装； s4.将真空包装后的块菌采取翻转方式进行电子束辐照，得到块菌产品，所述的辐照吸收剂量为1.5kgy，所述的翻转方式是指将块菌包装进行上下面的翻转，即双面辐照；所述的具有原始香气的块菌产品在10天货架期的指标如下：3-甲基丁醛含量：8.56
±
3.58%、苯乙醛含量：0.69
±
0.21%、壬醛含量：0.15
±
0.02%、反-2-辛烯醛含量：0.19
±
0.07%、2-甲基丙醇含量：7.48
±
4.07%、2-甲基丁醇含量：14.08
±
4.35%、1-辛烯-3-醇含量：19.89
±
11.17%、3-甲基丁醇含量：3.83
±
0.10%、3-辛醇含量：3.28
±
1.55%、1-辛醇含量：3.00
±
1.03%、1-壬醇含量：0.20
±
0.08%、乙醇含量：15.08
±
11.96%、癸醇含量：0.12
±
0.07%、苯乙醇含量：2.37
±
0.92%、反式-2-辛烯醇含量：0.91
±
0.25%、反-5-癸烯醇含量：1.69
±
0.96%、3-辛酮含量：0.84
±
0.98%、2-十一酮含量：0.04
±
0.01%、庚酸乙酯含量：3.43
±
0.97%、辛酸甲酯含量：0.14
±
0.05%、庚酸异丁酯含量：2.19
±
0.75%、庚酸-3-甲基丁酯含量：0.48
±
0.15%、1-甲基庚酸乙酯含量：0.10
±
0.03%、2-甲基庚酸丁酯含量：0.52
±
0.21%、藜芦醚含量：1.15
±
0.42%、4-甲基藜芦醚含量：0.12
±
0.02%、3-甲基苯甲醚含量：2.06
±
0.56%、甘菊蓝含量：0.18
±
0.03%、乙醛酸含量：4.64
±
1.87%、4-庚烯基苯含量：0.05
±
0.02%。
10.所述步骤s2中，三次风干后块菌的含水率控制在15-25%。
11.所述块菌产品在其货架期内，满足以下产品指标：失重率2.8-4.9%、菌落总数4.2-4.7 log cfu/g、弹性48-47%、硬度2800-3200g、ppo酶活80-90 u/g、总多酚含量2.5-3.5 mm ga equiv g-1、可溶性蛋白含量50%
‑ꢀ
60% mg/g、还原糖含量2.7
–
2.2mg/g。
12.一种保留原始香气的块菌产品，采用上述工艺制备得到，所述块菌产品于4℃下储存，最佳货架期为10天。本发明所述最佳货架期是指在此期间块菌能保留较为明显的特征香气。
13.本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：本发明对采收后的块菌采用盐水浸泡淘洗、过滤、三次风干、真空包装、1.5kgy电子束辐照的方式进行保鲜处理，可使块菌产品具备以下优势：a.在低温水下将块菌中的杂质和表面细菌物进行清洗，同时清洗过程尽量减少原始香气的丧失。
14.b.多次风干可让块菌的水分缓慢释放，同时让每一个块菌都能够得到均匀的干
燥，使得各部分的含水率保持一致。
15.c.真空包装可减少水分的丧失，同时，为了在辐照时便于翻转。
16.d.采用双面辐照工艺可使包装后的块菌能够得到均匀的辐照。
17.e.有利于块菌产品原始香气的保留，且在4℃下储存，具有0-10天的货架期。
18.f.可使块菌在0-10天贮藏期内维持较低菌落数，因此，能较好保持其安全性。
19.g.能有效控制其失重率在2.8-4.9%，较好维持产量以及口感的滋润度。
20.h.可有效维持块菌的质构特征，使得其硬度和弹性在贮藏期中基本保持稳定不变（p 》 0.05），有效延缓块菌软化。
21.i.可使块菌在整储藏期间内能够有效抑制其ppo酶活。
22.j.可使块菌的多酚含量在整个储藏期间变化较为平稳，与初期多酚含量无显著性差异，对块菌的氧化损伤非常低，同时延缓块菌腐烂过程k.可使块菌的还原糖含量下降率低，对块菌不会造成明显伤害，还可有效抑制块菌呼吸作用，从而延缓块菌品质劣变。
23.l.可使块菌在整个储藏期间脂质氧化无显著性增加，不会加深块菌的脂质氧化程度。
24.m.可维持可溶性蛋白含量，延缓块菌可溶性蛋白含量降低，从而延长块菌货架期。
25.n.可使块菌的原始香气在整个储藏期间无明显损失，还能对块菌呈香物质产生积极的影响，可以提高块菌呈香物质1-辛醇和辛酸甲酯的相对含量，在整个储藏期间都能检出3-辛酮和辛酸甲酯，第10天还能检出2-十一酮和3-甲基丁醇，其中，3-甲基丁醇是非常重要的松露香气味。
26.综上所述，本发明利用电子束辐照工艺对块菌进行保鲜处理，不仅可使块菌在货架期内维持其特定的质构和生理生化特征，还能保留块菌特有的原始香气特征，同时，延长块菌货架期为0-10天。
附图说明
27.图1为不同处理组在储藏期间失重率的变化图。
28.图2为不同处理组在储藏期间的菌落总数变化图。
29.图3为不同处理组在储藏期间硬度的变化图。
30.图4为不同处理组在储藏期间弹性的变化图。
31.图5为不同处理组在储藏期间ppo酶活的变化图。
32.图6为多酚测定标准曲线图。
33.图7为不同处理组在储藏期间多酚的变化图。
34.图8为可溶性蛋白测定标准曲线图。
35.图9为不同处理组在储藏期间可溶性蛋白的变化。
36.图10为不同处理组的可溶性蛋白sds-page电泳分析图。
37.图11为还原糖测定标准曲线图。
38.图12为不同处理组在储藏期间还原糖的变化图。
39.图13为过氧化脂质测定标准曲线图。
40.图14为不同处理组在储藏期间脂质过氧化物的变化图。
41.图15为不同处理组在储藏期间tbars值的变化图。
42.图16为不同处理组在储藏期间挥发性呈香物质的变化表（一）。
43.图17为不同处理组在储藏期间挥发性呈香物质的变化表（二）。
44.图中，vp+1.5k指真空+ 1.5kgy处理，vp+2.5k指真空+ 2.5kgy处理，“—”：表示未检出。
具体实施方式
45.下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“%”均为重量百分比。
46.按本发明所述方法进行以下实施例1-4，块菌采用四川攀枝花产的印度块菌（t. indicum）。
47.实施例1：块菌采收后用泥土覆盖和冰盒低温（4℃）保存，用20℃以下的25%盐水进行浸渍，浸渍35分钟后，淘洗、过滤，重复三次以上，可去除表面泥土和杂质。然后将处理后的块菌通过环流风干设备进行三次风干，本实施例所指环流风干设备是指采用环形出风管道对块菌的四周形成均匀风干，第一次风干时设备控制温度在30-35℃
°
，第二次风干时设备温度在50-55℃，第三次风干时设备温度在70℃，风干后的块菌含水率控制在20%，并确保在24 h内进行处理。将上述处理后的块菌送至真空包装机包装成袋，控制真空包装袋的真空度为200pa。再将真空包装后的块菌采取翻转方式进行电子束辐照，得到块菌产品，并置于4℃储存。电子束辐照时，控制辐照吸收剂量为1.5kgy，翻转方式是指将块菌包装进行上下面的翻转，即双面辐照。
48.实施例2：块菌采收后用泥土覆盖和冰盒低温（4℃）保存，用20℃以下的30%盐水进行浸渍，浸渍45分钟后，淘洗、过滤，重复三次以上，可去除表面泥土和杂质。然后将处理后的块菌通过环流风干设备进行三次风干，本实施例所指环流风干设备是指采用环形出风管道对块菌的四周形成均匀风干，第一次风干时设备控制温度在35-40℃
°
，第二次风干时设备温度在55-60℃，第三次风干时设备温度在70℃，风干后的块菌含水率控制在15%，并确保在24 h内进行处理。将上述处理后的块菌送至真空包装机包装成袋，控制真空包装袋的真空度为200pa。再将真空包装后的块菌采取翻转方式进行电子束辐照，得到块菌产品，并置于4℃储存。电子束辐照时，控制辐照吸收剂量为1.5kgy，翻转方式是指将块菌包装进行上下面的翻转，即双面辐照。
49.实施例3：块菌采收后用泥土覆盖和冰盒低温（4℃）保存，用20℃以下的28%盐水进行浸渍，浸渍50分钟后，淘洗、过滤，重复三次以上，可去除表面泥土和杂质。然后将处理后的块菌通过环流风干设备进行三次风干，本实施例所指环流风干设备是指采用环形出风管道对块菌的四周形成均匀风干，第一次风干时设备控制温度在40℃
°
，第二次风干时设备温度在50℃，第三次风干时设备温度在70℃，风干后的块菌含水率控制在18%，并确保在24 h内进行处理。将上述处理后的块菌送至真空包装机包装成袋，控制真空包装袋的真空度为200pa。再将真空包装后的块菌采取翻转方式进行电子束辐照，得到块菌产品，并置于4℃储存。电
子束辐照时，控制辐照吸收剂量为1.5kgy，翻转方式是指将块菌包装进行上下面的翻转，即双面辐照。
50.实施例4：块菌采收后用泥土覆盖和冰盒低温（4℃）保存，用20℃以下的25%盐水进行浸渍，浸渍30分钟后，淘洗、过滤，重复三次以上，可去除表面泥土和杂质。然后将处理后的块菌通过环流风干设备进行三次风干，本实施例所指环流风干设备是指采用环形出风管道对块菌的四周形成均匀风干，第一次风干时设备控制温度在35-38℃
°
，第二次风干时设备温度在50-55℃，第三次风干时设备温度在70℃，风干后的块菌含水率控制在25%，并确保在24 h内进行处理。将上述处理后的块菌送至真空包装机包装成袋，控制真空包装袋的真空度为200pa。再将真空包装后的块菌采取翻转方式进行电子束辐照，得到块菌产品，并置于4℃储存。电子束辐照时，控制辐照吸收剂量为1.5kgy，翻转方式是指将块菌包装进行上下面的翻转，即双面辐照。
51.将上述实施例1作为真空+1.5 kgy辐照组（vp+1.5 kgy），设置实验分组（实验过程中，应保证每组采用的块菌成熟度一致，可通过将处理后的块菌样品切开小口并观察颜色进行挑选），每组设3个平行，如下所示：对照组（control）：未采用任何保鲜处理的空白对照。
52.真空包装组（vp）：与实施例1的区别仅在于未采用电子束辐照处理。
53.真空+2.5 kgy辐照组（vp+2.5 kgy）：与实施例1的区别仅在于电子束辐照的辐照吸收剂量为2.5 kgy。
54.将上述四个实验组分别进行以下实验：（一）失重率测定块菌采后生命活动仍在进行，呼吸作用和酶解作用会导致大量的水分和有机物损失，因此，采用称量法。对每个时间点的块菌样品进行称重，计算失重率。
55.图1所示为块菌产品在储藏过程中失重率的变化。在整个储藏过程中，块菌失重率随着货架期的延长而逐渐增加，对照组的失重率最高，为4.2-5.9%，真空包装组和辐照组可以降低块菌的失重率，其中，真空+1.5 kgy辐照组的失重率最低，失重率为2.8-4.9%。说明1.5 kgy辐照与真空包装联用可以更加显著地降低块菌失重率（p 《 0.05）。
56.（二）菌落计数微生物侵染是食用菌腐烂的主要原因之一，因此，需要对保鲜处理后的块菌产品进行菌落计数。菌落总数采用平板菌落计数法检测，操作方法参考gb 4789.2-2016食品微生物学检验-菌落总数测定并做适当的修改。称取1.0 g块菌表皮样品，用手术刀均匀切碎，放入盛有9 ml无菌生理盐水的锥形瓶内，然后置于摇床以250 rpm振荡60 min，制成1:10的样液。吸取1:10样液1 ml，于装有9 ml生理盐水的无菌试管中，反复吹打均匀，制成1:100的样液。依次制备10倍系列稀释样品匀液。根据预实验结果，选择2个适宜稀释度的样液，吸取1 ml于无菌平皿内，每个稀释度重复两次，同时吸取1 ml无菌生理盐水为空白对照。然后及时倾注15-20 ml冷却至50 ℃的pca培养基（可提前放置于55 ℃恒温箱中），转动平板混匀，37 ℃静置培养48 h，计数。
57.图2所示为不同保鲜处理的块菌在储藏期间的菌落总数变化趋势。块菌辐照前后菌落总数的变化差异大，未辐照的块菌表面初始菌落数为8.2-8.8 log cfu/g，辐照后则为
4.2-4.7 log cfu/g，降低了50%左右。总体上，块菌表面的菌落总数随着货架期的延长而逐渐增加。在0-15天，真空包装组的菌落总数与对照组无显著性差异（p 》 0.05），辐照组则显著性低于对照组（p 《 0.05）；在第20天，真空包装组的菌落总数增加并显著性高于对照组（p 《 0.05），应该是在储藏末期真空包装袋里的湿度增加反而会促进微生物生长；真空+1.5 kgy辐照组的菌落总数从第10天开始增加直至第20天与对照组无显著性差异（p 》 0.05），说明真空+1.5 kgy辐照剂量处理可以使块菌在0-15天内保持较低的菌落数，随后优势菌回复生长导致总数增加；而真空+2.5 kgy处理组的菌落总数在整个储藏期间都低于4.5 log cfu/g，说明真空+2.5 kgy电子束辐照剂量处理可以使块菌始终处于低菌落状态。
58.（三）质构测定硬度是块菌评价的重要指标之一，测定方法如下：样品处理：为了测定结果的准确，需要将块菌制成形状、大小统一的样品。利用直径为1 cm的打孔器以及间距为0.5 cm的双刀片将去皮后的块菌切成直径为1 cm，高为0.5 cm的圆柱体。质构测定模式：hold until time (dist)；测试参数：测试模式压缩，测前速度1.00 mm/sec，测中速度1.00 mm/sec，测后速度10.00 mm/sec，形变量25%，保持时间60 sec，触发力5 g；探头类型：p/36r；测定指标：弹性和硬度。
59.图3所示为不同处理组在储藏期间硬度的变化，由图3可以看出，块菌产品在储藏过程中硬度呈逐渐降低的趋势。对照组和真空+2.5 kgy辐照组的硬度随着货架期的延长明显降低，且两组无显著性差异（p 》 0.05）；真空+1.5 kgy辐照组和真空包装组在0-15天内显著高于对照组（p 《 0.05）。真空包装组的硬度是先增加而后在第10天迅速降低，第20天与对照组无显著差异（p 》 0.05），说明仅仅只是真空包装的块菌只能在短时间内维持块菌的硬度，超过10天就开始腐烂软化。真空+1.5 kgy辐照组的硬度在第5天略微增加，而后基本保持稳定，并且与第0天的块菌硬度无显著性差异（p 》 0.05），说明真空+1.5 kgy电子束辐照可以有效延缓块菌软化，0-10天硬度2800-3200g 。
60.弹性可以评价块菌受到外力挤压后恢复到原有形态的能力。图4所示为块菌在储藏过程中弹力的变化趋势，与硬度的变化趋势较一致。从图中可以可看出，块菌的弹性随着货架期的延长而逐渐降低。对照组和真空+2.5 kgy辐照组的弹性随着货架期的延长明显降低，且除第5天两组无显著性差异（p 》 0.05）；真空包装组在10-15天内显著高于对照组（p 《 0.05），第15天又迅速降低；真空+1.5 kgy辐照组的弹性整个储藏期间都高于对照组，且与第0天的弹性无显著性差异（p 》 0.05），说明真空+1.5 kgy的电子束辐照可以有效延缓块菌弹力的降低，0-10天弹性48-47%。
61.综合硬度和弹性两个指标，相较于其他组，真空+1.5 kgy辐照组可以提高块菌在储藏期间的硬度和弹性，很好的维持块菌的质构特征。真空+2.5 kgy的电子束辐照对块菌的硬度和弹性不但没有提高作用，反而还促进块菌的软化，可能是因为真空+2.5 kgy的辐照剂量过高，产生的大量自由基加快了块菌脂质和蛋白氧化的氧化进程，胞壁结构受损，从而导致软化现象的产生。
62.（四）多酚氧化酶（ppo）活力ppo酶活是评价食用菌褐变的重要指标之一，也能反映在储藏过程中食用菌受损伤程度。ppo活力采用邻苯二酚比色法测定。取块菌1.0 g加入9 ml ph 6.8 0.05 mol/l的磷酸缓冲液（含1% pvpp），在冰浴中充分研磨，10000 r/min离心10 min，两层滤纸过滤去除
胶质，滤液备用，用于ppo活力和可溶性蛋白的测定。
63.取试管a加入1.25 ml ph 6.8的磷酸缓冲液，在40 ℃温浴10 min，加入0.25 ml 40 ℃预热的样液，立即加入0.25 ml 20%的三氯乙酸溶液使酶失活，混匀，然后加入0.25 ml 0.3 mol/l邻苯二酚，8000 r/min离心5 min，取上清，于波长410 nm处测定溶液吸光度a1，此为反应开始时的数值。同时，以磷酸缓冲溶液替代样液做相同处理，为空白对照。试管b加入1.25 ml ph 6.8的磷酸缓冲液，0.25 ml 0.3 mol/l邻苯二酚，摇匀，在40 ℃温浴10 min，加入0.25 ml预热的样液的同时开始计时，3 min后立即加人0.25 ml 20%的三氯乙酸溶液，8000 r/min离心5 min，取上清，于波长410 nm处测溶液的吸光度a2，此为反应终止时的数值。其中a=a2-a1，以
∆
a变化0.01为一个酶活力单位计算酶活。
64.图5所示为块菌在储藏过程中ppo酶活的变化趋势。从图中可以看出，块菌在储藏期间ppo酶活呈先升高后降低，总体呈逐渐升高的趋势。对照组和普通真空组的ppo酶活在第5天就达到峰值，而真空+1.5 kgy和真空+2.5 kgy辐照组分别在20天和第15天达到峰值，说明电子束辐照可以推迟块菌ppo酶活峰值的到来，而1.5 kgy剂量的抑制效果最为明显（0-10天时ppo酶活80
–
90u/g）。在0-5天内，辐照组和真空包装组的ppo酶活显著低于对照组（p 《 0.05）；在5-20天内，真空+2.5 kgy辐照组和真空包装组的ppo酶活逐渐升高并与对照无显著性差异（p 》 0.05）；只有真空+1.5 kgy辐照组的ppo酶活在整个储藏期间都处于较低水平，比对照降低了30-70%。结果表明，真空+2.5 kgy电子束辐照剂量和普通的真空包装只能在储藏初期抑制ppo酶活，而1.5 kgy电子束辐照剂量可以在整储藏期间有效抑制块菌的ppo酶活。
65.食用菌采后受损会影响多酚含量、苯丙氨酸解氨酶（pal）和多酚氧化酶（ppo）的酶活，其中pal参与多酚的合成，而ppo则氧化多酚形成黑褐色的醌，多酚含量的变化可以评估块菌在储藏过程受到的损伤。
66.多酚含量采用folin酚法测定。取块菌1.0 g置于研钵加入9 ml 80%乙醇水溶液，充分研磨，室温避光孵育48 h。10000 r/min离心5 min，取上清液备用，加入0.2 ml样液于ep管中，然后加入0.4 ml 10% f-c试剂，涡旋3-8 min，加入1.4 ml na2co3，振荡混匀，室温避光孵育1 h，于765 nm处测定吸光值。同时，以80%乙醇水溶液替代样液做相同处理，作为空白对照。以0、40、60、80、100、200、400 μm没食子酸（gallic acid）溶液绘制标准曲线（如图6所示），根据标准曲线计算总酚含量。
67.图7所示为块菌在储藏过程中多酚含量的变化趋势。在整个储藏期间，所有处理组的多酚含量随着货架期的延长而逐渐增加，而对照组的多酚含量则是逐渐降低，原因可能是对照组的块菌没有密封包装，可以与空气中的氧气充分接触，同时ppo的酶活也远高于其他组，多酚则被迅速氧化，多酚含量相应降低。在0-5天内，所以处理组的多酚含量与对照相比并没有显著性差异（p 》 0.05），在10-20天，真空+2.5kgy辐照组的多酚含量显著增加并始终高于其他组（p 《 0.05），应该是高剂量的电子束辐照对块菌造成了不同程度的氧化损伤，从而产生大量的多酚对抗损伤；真空包装组的多酚含量在第15天突然陡增，可能是在储藏末期的块菌衰老腐烂积累大量的多酚，但因缺氧不能被氧化。相较于其他处理组，真空+1.5kgy辐照组的多酚含量在整个储藏期间的变化较为平稳（0-10天总多酚含量2.5-3.5mm ga equiv g-1
），且与初期的多酚含量无显著性差异（p 》 0.05），说明1.5 kgy的电子束辐照对块菌的氧化损伤非常低，同时延缓块菌腐烂的过程。
68.（六）可溶性蛋白测定方法块菌在储藏前期主要是消耗积累的糖类物质功能，若糖类物质供应不足就会优先降解自身的可溶性蛋白质。可溶性蛋白的测定采用双缩脲法。在试管中吸取上述样液 0.5 ml，加入2 ml双缩脲试剂，充分混合，37 ℃放置30 min，于540 nm处测定吸光度，以缓冲溶液替代样液做相同处理，作为空白对照。以0、2、4、6、8、10 mg/ml牛血清蛋白（bovine serum albumin, bsa）溶液绘制标准曲线（如图8所示），根据标准曲线计算可溶性蛋白含量。
69.图9所示为块菌在储藏过程中可溶性蛋白含量的变化趋势。从图中可以看出，不同处理组在储藏期间的可溶性蛋白含量变化波动大，总体趋势是先降低后增加，随后又降低。在0-10天内，普通真空组的可溶性蛋白含量高于其他组，显著高于对照组（p 《 0.05），从第10天开始又迅速降低，应该是块菌自身供能不足从而降解可溶性蛋白以维持基础的生命活动。在储藏后期10-20天内，真空+1.5 kgy辐照组可溶性蛋白含量增加并高于其他组，0-10天可溶性蛋白含量50%
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60% mg/g 。1.5 kgy电子束辐照剂量可以延缓块菌可溶性蛋白含量的降低，从而延长块菌货架期。
70.（七）sds-page检测块菌蛋白降解情况sds-page凝胶的制备由10%分离胶和5%浓缩胶组成。分离胶制备：蒸馏水、30% acr-bis （29:1）、1.5 m tris （ph 8.8）、10% sds等成分按下表1在试管中混匀；吸取分离胶溶液沿壁缓慢加入已验漏的玻璃板，离玻璃板顶端3cm处停止加液；随后轻轻加入1-2 ml无水乙醇，压平凝胶表层；待凝胶凝固，弃去无水乙醇，并吸干残留的无水乙醇。浓缩胶制备：将蒸馏水、30% acr-bis （29:1）、1 m tris （ph 6.8）、10% sds等成分按下表1在试管中混匀；吸取浓缩胶溶液沿壁急需加满玻璃板，插入梳子，且梳子底部与玻璃板项端相平；待凝胶凝固，拔出梳子。上样：样品与上样缓冲液4:1混合，沸水水浴10 min后上样，上样量为15 μl。跑样：先80 v恒压，10 min后，待溴酚蓝指示剂到分离胶与浓缩胶分界处，调节电压为120 v，溴酚蓝指示剂接近凝胶底部时停止电压，小心取下凝胶进行染色和脱色，直至凝胶背景清晰。
71.表1 各层凝胶的组成图10所示为储藏过程中不同处理组的可溶性蛋白sds-page电泳分析。不同处理组的条带会有所不同，主要是因为块菌子实体的个体差异造成的。从sds-page电泳图可以看出，块菌可溶性蛋白的分子量都低于140 kda，主条带分别为135、120、97、65、63、50、48 kda，说明不同品种的块菌其蛋白分子量也会有所差异。块菌可溶性蛋白的主条带消失时间，可以反映在储藏期间不同处理组可溶性蛋白的降解趋势和速度。整体上看，对照组和普
通真空组的可溶性蛋白的降解情况最为严重。对照组第5天就能观察到135 kda的条带变淡，50和48 kda的条带几乎消失；普通真空组在第5天同样能观察到135 和65 kda的条带几乎消失，降解情况比对照组略微严重一点；真空+2.5 kgy辐照组在第15天观察到50 kda的条带变淡，135、65和63 kda的条带几乎消失；真空+1.5 kgy辐照在第20天与第0天相比没有任何条带降解消失，只有主条带略微变淡而已。普通真空包装会加重块菌在储藏期间可溶性蛋白降解情况，电子束辐照可以延缓其降解速率，其中1.5 kgy电子束辐照剂量的效果则更为明显。
72.（八）还原糖含量测定方法还原糖是食用菌采后主要的呼吸底物，其含量随着呼吸作用加剧而逐渐降低。还原性糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸法。样品处理：称取1.0 g块菌，切碎后放入研钵中，加入9 ml ph 6.8的磷酸缓冲液迅速研磨，80 ℃水浴30 min，使还原糖浸出，10000 r/min离心10 min，取上清液备用。测定方法：吸取0.5 ml样品于10 ml试管中，加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀，沸水水浴5 min，迅速冷却至室温，补加蒸馏水至10 ml，混匀，于波长540 nm处测定吸光度。以磷酸缓冲液替代样液做相同处理，作为空白对照。以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml葡萄糖溶液绘制标准曲线（如图11所示），根据标准曲线计算还原性糖含量。
73.图12所示为块菌在储藏过程中还原糖含量的变化趋势。从图中可以看出，所有组的还原糖含量随着货架期的延长而不断降低。在整个储藏期间，对照组、真空组、真空+2.5 kgy辐照组和真空+1.5 kgy辐照组储藏末期的还原糖含量与初期相比分别降低了5.12、4.84、1.74和0.50 mg/g，下降率分别为82.67% 、79.14%、27.71%和18.12%。其中辐照组的还原糖含量下降率明显小于其他组，说明一定剂量的电子束辐照可以降低块菌的呼吸速率。真空+2.5 kgy辐照组的还原糖含量下降率高于真空+1.5 kgy辐照组，可能是辐照剂量过高导致块菌表面受到损伤，在辐照损伤修复之前需要增强呼吸作用提供更多的能量。因此，1.5 kgy电子束辐照剂量对块菌不会造成明显伤害，还可以有效抑制块菌的呼吸作用，从而延缓块菌品质的劣变，，0-10天还原糖含量2.7
–
2.2mg/g 。
74.（九）脂质氧化水平检测方法块菌的不饱和脂肪酸在储藏过程中受到自由基的氧化作用会形成脂质过氧化物，脂质过氧化是脂质氧化的初级反应，而电子束辐照产生的自由基可能会加重块菌的脂质氧化程度。
75.样品处理：称取1.0 g块菌，切碎后放入研钵中，加入9 ml预冷的80%乙醇水溶液（含0.01% bht）研磨充分，10000 r/min离心5 min，取上清液，用以测定过氧化脂质和tbars值。
76.过氧化脂质（lipid peroxide, lpo）测定采用氧化铁二甲酚橙法
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（ferrous oxidation xylenol orange assay
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, fox
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）。测定方法：取两只2.0 ml ep管先加0.5 ml样液，然后分别加入0.1 ml 10 mm tpp(+tpp)和甲醇(-tpp)，涡旋振荡1 min，室温孵育30 min，最后加入1 ml fox反应液（fox反应液：精确称取1.33 ml h2so4、69.5 mg fe2so4-7h2o、76.1 mg二甲酚橙、880 mg bht溶于1 l双蒸馏水中，配制成含25 mmol/l h2so4 、0.25 mmol/l fe2+ 、0.1 mmol/l二甲酚橙、4 mm bht的fox反应液），室温孵育30 min，于波长560 nm处测吸光度值abs560 [+tpp]和abs560 [-tpp]，abs560 looh= abs560 [-tpp]
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abs560 [+tpp]。以浓度为0、5、10、15、20、25 μm h2o2溶液绘制标准曲线（如图13所示），根据标准曲线计算样品lpo含量。
[0077]
脂质氧化测定采用硫代巴比妥酸反应物法（thiobarbituric acid reactive substance assay, tbars）。准确吸取滤液1.0 ml，加入1.0 ml 0.02 mol/l硫代巴比妥酸溶液[+tba]或蒸馏水[-tba]，混匀，于90℃水浴内反应20 min。以80%乙醇水溶液为空白调零，于532 nm波长处测定吸光值abs532 [+tba]或abs560 [-tba]，abs532 = abs532 [+tba]
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abs560 [-tba]。
[0078]
图14所示为块菌在储藏期间过氧化脂质含量的变化趋势。总体上，块菌的过氧化脂质随着货架期的延长呈先增加后降低的趋势，可以看出块菌的脂质过氧化反应在0-10天内比较剧烈。在储藏初期，电子束辐照后的块菌的脂质过氧化物含量明显升高；在5-15天内，真空+2.5 kgy辐照组和普通真空组的过氧化脂质含量高于对照组和真空+1.5 kgy辐照组，并显著高于对照组（p 《 0.05）。电子束辐照1.5 kgy和2.5 kgy两个剂量都会加重块菌脂质过氧化，且剂量越高越严重。普通的真空包装也会加重块菌的脂质过氧化，而1.5 kgy电子束辐照和真空包装联用可以降低块菌脂质过氧化的程度。
[0079]
tbars值表征脂质氧化的稳定终产物如丙二醛等醛类物质的含量，可以用来衡量脂质氧化的水平。图15所示是不同处理的块菌在储藏期间tbars值的变化趋势。从图中可以看出，块菌tbars值随着货架期的延长而逐渐增加。真空+2.5 kgy辐照组的tbars值增加速率最高，在5-20天内tbars值都显著高于其他组（p 《 0.05），而在整个储藏期间真空+1.5 kgy辐照组和普通真空组与对照相比无显著性差异（p 》 0.05）。2.5 kgy辐照电子束辐照剂量促进了块菌脂质氧化，可能会导致块菌的不饱和脂肪酸损失严重，脂膜结构老化，而1.5 kgy电子束辐照剂量并不会加深块菌的脂质氧化程度。
[0080]
（十）块菌挥发性呈香物质检测方法香气是块菌品质最重要的评价指标。利用gc-ms检测块菌的挥发性呈香物质。顶空固相微萃取条件：取1 g块菌（切成2 mm厚度的片状）于20 ml顶空萃取瓶中密封，53℃平衡5 min，将老化好的spme萃取头（50/30 μm dvb/car/pdms）插入，顶空萃取14 min。色谱条件：接口温度为200 ℃，解吸5 min。载气为高纯氦气，恒定流速1.0 ml/min。采用程序升温，初始温度40 ℃，然后以4 ℃/min的速度升至140 ℃，接着，以10 ℃/min的速度升至220 ℃；维持10 min。质谱条件：离子源温度200 ℃，发射电流70 μa，质朴扫描范围45-250 m/z。
[0081]
图16、图17所示为不同处理组在储藏期间主要的挥发性呈香物质成分和相对含量的变化。块菌的香气复杂多样，个体差异也较大，实际检出的挥发性物质累计超过200种，表中仅列出了检出率高或有文献报道的39种挥发性物质。从图中可以看出，四川攀枝花产地的块菌的挥发性呈香物质主要是醇类（11种）、醛类（10种）、酯类（10种）和醚类（3种）物质。
[0082]
对照组呈香物质的种类和相对含量随着货架期的延长都相应减少，香气损失严重，从初期的25种物质到末期只能检出15种，如醛类物质：苯甲醛、(z)-4-癸烯醛、反-2-辛烯醛，醇类物质：3-甲基丁醇(酒的重要风味物质之一)、1-壬醇（类似于香茅油气味）、反式-2-辛烯醇（油脂香味又伴有腥臭味），及2-十一酮（有油脂气息和类似芸香的香气，低浓度时具有桃子香气，存在于牛肚菌和印度块菌中）和1-甲基庚酸乙酯等呈香物质在初期有检出，而到第10天就无法检出，壬醛（具有强烈的油脂气味和甜橙气息）、反-5-癸烯醇、3-辛酮（有果实香味）、藜芦醚（存在于普洱茶）等在初期检出，到末期就无法检出；1-辛醇（具有柠檬气
味）、1-辛烯-3-醇（又称蘑菇醇，具有强烈的蘑菇香气）、苯乙醛（具有类似风信子的香气）、庚酸-3-甲基丁酯、庚酸乙酯（有菠萝香气味）的相对含量逐渐降低，降低率分别为87.76%、84.13%、74.54%、73.84%、60.79%。普通真空组的香气损失相较于对照组有轻微缓解，呈香物质从初期的24种降低至17种，如苯甲醛（具有特殊的杏仁气味）、反-2-辛烯醛（呈脂肪和肉类香气，有黄瓜和鸡肉香味）、2-十一酮三种物质在初期检出，而到第10天就无法检出；3-甲基丁醛（天然存在于柑桔、柠檬等精油中）、壬醛、3-辛酮（有果实香味）、1-甲基庚酸乙酯、棕榈酸甲酯（天然存在于刺山柑果实挥发油中）、4-甲基藜芦醚等呈香物质在初期有检出，而到第10天就无法检出；苯乙醛、邻苯二甲醚、庚酸-3-甲基丁酯、庚酸异丁酯、1-辛醇、1-辛烯-3-辛醇、3-辛醇、庚酸乙酯的相对含量逐渐降低，降低率分别为61.33%、59.26%、56.53%、48.85%、41.28%、28.29%、22.31%。电子束辐照处理相较于对照和普通真空包装，不但没有加重块菌呈香物质的损失，反而还产生癸醛（具有脂香，稀释后有花香和橙香香气）和癸醇（具有蜡香、甜香、花香、果香香气）两种呈香物质。此外，电子束辐照还能保持或提高某些呈香物质的在整个储藏期间的相对含量，如1-辛烯-3-辛醇、反-2-辛烯醛、1-壬醇、反式-2-辛烯-1-醇、庚酸乙酯、3-甲基苯甲醚（具有类似依兰油和紫罗和兰的香气）、3-甲基丁醛。但是真空+2.5 kgy辐照组在第0天检出己醛，第10天的壬醛含量均高于其他组，而己醛和壬醛是脂质氧化的产物，说明真空+2.5 kgy辐照剂量确实会加重块菌的脂质氧化。真空+1.5 kgy辐照组在储藏初期检出29种物质，10天以后却能检出30种物质，说明1.5 kgy电子束辐照处理后的块菌的香气可以保持10天无明显损失。真空+1.5 kgy 辐照组可以提高块菌呈香物质1-辛醇和辛酸甲酯的相对含量，在整个储藏期间都能检出3-辛酮和辛酸甲酯，第10天还能检出2-十一酮和3-甲基丁醇，第20天还检出呈香物质甲酸辛酯（具有玫瑰和橙子的花果香气），其中，3-甲基丁醇是非常重要的松露香气味。
[0083]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。