遗传性神经病和相关障碍的治疗和检测
1.资金资助披露
2.本发明是在国立卫生研究院(nih)授予的基金号为ns065712和ns075764的政府资助下进行的。政府具有本发明的某些权利。
3.相关申请的交叉引用和通过引用并入电子提交的材料
4.本技术要求2019年5月7日提交的美国临时专利申请号62/844370和2020年3月9日提交的美国临时专利申请号62/987151的优先权，所述每项申请以全文引用的方式并入本文。
5.与本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表通过全文引用的方式并入本文，并标识如下：文件名：54095a_seqlisting.txt；大小：141930字节；创建日期：2020年5月5日。
技术领域
6.本公开涉及检测和治疗遗传性神经病的方法。


背景技术：

7.周围神经病是最常见的神经变性疾病，其中糖尿病性神经病和遗传起源是最常见的作用机制。对于遗传性神经病，也称为腓骨肌萎缩症(cmt)，患者的剩余诊断差距(remaining diagnostic gap)为约50％。根据我们的理解，cmt代表影响周围神经的临床和遗传异质性遗传单基因高度表型外显的病症的伞式概念(umbrella concept)。cmt根据传导速度分为脱髓鞘(cmt1)和轴突(cmt2)型。远端遗传性运动神经病(dhmn)代表cmt2的一种形式，其中疾病负担主要或完全地落在运动神经上(rossor，tomaselli和reilly 2016)。类似的病症包括als4(青少年dhmn+作为牵涉上运动神经元的迹象的瞬目反射)。与超过90％的病例具有在已知基因中的突变的cmt1相反，仅20到30％的cmt2和远端hmn患者接受了基因诊断(fridman等，2015)。


技术实现要素：

8.本公开提供了一种治疗和/或检测遗传性神经病的方法。在各种不同方面，所述方法包括检测来自受试者的样品中山梨糖醇脱氢酶(sord)基因中突变的存在。在各种实施方案中，sord突变是根据美国医学遗传学和基因组学学会(acmg)标准分类为致病或可能致病的dna变体。任选地，所述方法包括当检测到sord基因中存在突变时诊断患有遗传性神经病的受试者。任选地，所述方法包括向受试者施用组合物，该组合物包含选自以下的药剂：醛糖还原酶抑制剂；醛糖还原酶反义寡核苷酸；编码sord肽的多核苷酸；sord肽；阻断突变sord基因表达的药剂；以及纠正sord基因中的突变的药剂。在各种不同方面，所述方法包括向受试者施用阿司他汀、依帕司他、地帕司他、非达司他、伊米司他、利多司他、米那司他、波那司他、雷尼司他、salfredin b
11
、索比尼尔、托瑞司他、泽那司他或佐泊司他(或其组合)。在各种不同方面，所述方法包括向受试者施用醛糖还原酶反义寡核苷酸；编码sord肽的多
核苷酸；阻断突变sord基因表达的药剂；纠正sord基因中的突变的药剂；或上述任意的组合。在各种不同方面，所述方法包括向受试者施用sord肽。还考虑施用任何前述的组合。任选地，所述方法包括测量来自受试者的样品中的山梨糖醇水平。
9.还提供了以下各项用于治疗受试者的遗传性神经病(或用于制备治疗遗传性神经病的药物)的用途：(i)醛糖还原酶抑制剂(例如，阿瑞司他、依帕司他、地帕司他、非达司他、伊米司他、利多司他、米那司他、波那司他、雷尼司他、salfredin b
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、索比尼尔、托瑞司他、泽那司他和/或佐泊司他)(ii)醛糖还原酶反义寡核苷酸、编码sord肽的多核苷酸、阻断突变sord基因表达的药剂和/或纠正sord基因中的突变的药剂；和/或(iii)sord肽，所述受试者已测试了山梨糖醇脱氢酶(sord)基因中突变的存在。
10.本公开还提供了一种表征哺乳动物受试者的神经病的方法，所述方法包括测量患有神经病的受试者的山梨糖醇水平，其中高于约10g/l的山梨糖醇水平表明该神经病与山梨糖醇脱氢酶(sord)基因中的突变相关。本公开还提供了一种评估受试者的遗传性神经病的治疗效果的方法，所述方法包括向受试者施用选自以下的药剂：醛糖还原酶抑制剂(例如，阿瑞司他、依帕司他、地帕司他、非达司他、伊米司他、利多司他、米那司他、波那司他、雷尼司他、salfredin b
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、索比尼尔、托瑞司他、泽那司他和/或佐泊司他)、醛糖还原酶反义寡核苷酸、编码sord肽的多核苷酸、sord肽、阻断突变sord基因表达的药剂和纠正sord基因中的突变的药剂(或上述任意的组合)；并测量受试者中山梨糖醇的水平。
11.应当理解，本文描述的每个特征或实施方案或组合是本公开的任何方面的非限制性、说明性的实例，并且因此意在可与本文描述的任何其他特征或实施方案或组合组合。举例来说，在使用例如“一个实施方案”、“一些实施方案”、“各种不同实施方案”、“相关实施方案”之类的语言描述特征的情况下，这些类型的实施方案中的每一个都是旨在用于可以与本文描述的任何其他特征或特征组合相组合的特征的非限制性实例，而不必列出每个可能的组合。这样的特征或特征组合适用于本发明的任何方面。
12.本文中的标题是为了方便读者而不是为了限制。从详细描述和/或附图和/或权利要求书中，本发明的其它方面、实施方案和变型将是清楚的。
附图说明
13.图1a-f.sord基因和谱系。sord中的双等位基因突变导致常染色体隐性dhmn/cmt2。(图1a)携带sord中的双等位基因突变的dhmn/cmt2家族的代表性谱系。正方形表示雄性，圆形表示雌性。对角线用于死亡的个体。患者用实心的形状表示。(图1b)基于ncbi参考序列：nm_003104.6，示出了sord的所有外显子、内含子和非翻译区(utr)的示意图。灰色和白色框分别代表sord的编码序列和utr。在本研究中考虑的家族中鉴定的变体映射在基因的整个编码区。以特别高频率鉴定外显子7上的无义c.757delg；p.(ala253glnfster27)变体。(图1c)sord蛋白结构域上的突变分布。(图1d)sord蛋白直系同源物比对，显示本研究中在dhmn/cmt2家族中鉴定的四个错义置换位于在从人类到大象的物种间高度保守的残基处。(图1e和1f)sord(反向链)和sord2p(正向链)的外显子7中高度同源区域的核苷酸序列的放大。sord2p与sord中不同的核苷酸用箭头表示，包括sord2p中的图1c缺失。代表性电泳图显示在sord中，dhmn/cmt2患者中发现的纯合状态和现有专利中发现的杂合状态的c.757delg；p.(ala253glnfster27)变体(右框，上图)在健康对照组中的双等位基因状态中
不存在(右框，下图)，但它固定在sorp2p中(左框，下图)。
14.图2a-c.患者成纤维细胞中减少的sord表达和山梨糖醇积累。(图2a)将葡萄糖转化为果糖的两步多元醇途径的示意图。(图2b)使用多克隆抗体ab189248示出sord蛋白质水平的免疫印迹，并相对于健康对照(n＝4，泳道1-4)，sord中c.757delg；p.(ala253glnfster27)变体的杂合携带者(n＝2，泳道10-11)和携带纯合c.757delg；p.(ala253glnfster27)改变的患者(n＝4，泳道5-8)或复合杂合c.757delg；p.(ala253glnfster27)变体以及第二无义c.895c》t；p.(arg299ter)突变(n＝1，泳道9)中的微管蛋白标准化。(图2c)通过uplc测量的细胞内山梨糖醇水平，并相对于健康对照(n＝5)和携带sord中双等位基因无义突变的患者(n＝5)中的蛋白质含量标准化。图表显示平均值
±
s.d和数据分布(点)。采用双尾t检验以组间比较sord编码蛋白(图2b)或山梨糖醇水平(图2c)。如果p-值《0.05、《0.01或《0.001，统计学显著性分别用*、**或***表示。所有实验均独立重复两次，结果相似。
15.图3a-f.果蝇sord2的缺失导致年龄相关性突触变性。(图3a)果蝇视觉系统的3d结构，显示了神经板、髓质和小叶。示出了显示光感受器末端和神经板神经元的xy-和xz-平面。(图3b)yw对照苍蝇的2dae的神经板。组织化的神经板筒(lamina cartridges)和柱状光感受器神经元分别在xy-平面和xz-平面中示出。(图3c)在2dae和10dae的sodh2
mb01265/mb01265
纯合苍蝇的神经板。箭头表示神经板空泡。方框表示神经板的更高放大率的区域。显示了brp的强度。虚线表示神经板空泡的区域。比例尺：30μm。(图3d)空泡数目、尺寸和brp强度的定量。对每组的总共3个神经板进行定量。数据表示为平均值
±
s.d。使用双因素方差分析接着和后验tukey多重比较检验进行统计分析。*p《0.05,**p《0.01,****p《0.0001。(图3e-3f)对照苍蝇(yw)和sodh2
mb01265/mb01265
(图3e)或sodh1和sodh2泛神经元双重敲减(rnai)(图3f)苍蝇的自发活动。每组n＝10。数据表示为平均值
±
s.d。使用双因素方差分析接着后验tukey多重比较检验进行统计分析。****p《0.0001。
16.图4a-g.醛糖还原酶抑制剂依帕司他和雷尼司他治疗降低山梨糖醇水平并恢复功能。(图4a)用依帕司他100μm、雷尼司他10μm或dmso治疗三天后，通过uplc测量并相对于来自健康对照(n＝5，圆点)和携带sord中双等位基因无义突变的患者(n＝5，方点)的成纤维细胞中的蛋白质含量标准化的细胞内山梨糖醇水平。(图4b)在卵封闭(eggs enclosure)后10天，通过uplc从大脑/头部匀浆中测量并相对于野生型(yw，空心圆点)、sodh2
mb01265/mb01265
(实心圆点)及神经元特异性sodh1敲减和通过rnai的sodh1抑制(方点)的果蝇的蛋白质浓度标准化的山梨糖醇水平。sodh2模拟及sodh1和soh2 rnai果蝇喂药80μm依帕司他、80μm雷尼司他或dmso。图表示出平均值
±
s.d。进行双尾t检验以比较山梨糖醇水平。如果p-值《0.05、《0.01或《0.001，统计学显著性分别表示为*、**或***，除非另有说明。所有实验均独立重复两次，结果相似。(图4c)用dmso喂药的对照苍蝇(yw)、用dmso、80μm依帕司他或80μm雷尼司他喂药的sodh2
mb01265/mb01265
苍蝇的自发活动(每组n＝10)。数据以平均值
±
s.d表示。使用双因素方差分析，然后后验tukey多重比较检验进行统计分析。*p《0.05,***p《0.001。(图4d-4f)在10dae和40dae，喂食dmso(图4d)、80μm依帕司他(图4e)或80μm雷尼司他(图4f)的sodh2
mb01265/mb01265
纯合苍蝇的神经板。箭头表示神经板空泡。方框表示神经板的更高放大率的区域。显示了brp的强度。虚线表示神经板空泡的区域。比例尺：30μm。(图4g)(图4d-4f)的空泡数量、大小和brp强度的定量。n＝3。数据以平均值
±
s.d表示。使用双因素方差分析，
然后后验tukey多重比较检验进行统计分析。*p《0.05,**p《0.01,****p《0.0001。
17.图5.携带sord中双等位基因突变的家族的谱系。正方形表示雄性，圆形表示雌性。对角线用于死亡的个体。患者用填充的形状表示。
18.图6a-b.果蝇sodh1和sodh2的双重敲减导致年龄相关性突触变性。(图6a)在2dae和10dae的sodh1和sodh2双重敲减纯合苍蝇的神经板。箭头表示神经板空泡。方框表示神经板的更高放大率的区域。显示了brp的强度。虚线表示神经板空泡的区域。比例尺：30μm。(图6b)空泡数量、大小和brp强度的定量。对每组的总共3个神经板进行定量。数据以平均值
±
s.d表示。使用双因素方差分析，然后后验tukey多重比较检验进行统计分析。*p《0.05,**p《0.01,****p《0.0001。
19.图7.用醛糖还原酶抑制剂依帕司他和雷尼司他的治疗恢复sodh1和sodh2双重敲减苍蝇的运动功能。喂药dmso的对照苍蝇(yw)(点，对于指示的每个dae点左侧的第一个数据点)，或喂药dmso(正方形，对于指示的每个dae点左侧第二个数据点)、80μm依帕司他(正方形，对于指示的每个dae点左侧第三个数据点)或80μm雷尼司他(正方形，对于指示的每个dae点左侧第四个数据点)的sodh1和sodh2神经元特异性敲减的苍蝇的自发活动。每组n＝10。数据以平均值
±
s.d表示。使用双因素方差分析，然后后验tukey多重比较检验进行统计分析。***p《0.001,****p《0.0001。
20.图8.编码sword肽的示例性表达载体(paav-sord)的图示。
21.图9.示例性完全aav载体dna序列，其包括sord编码序列(paav-sord)(seq id no:1)。
22.图10.sord引物序列和热循环条件。pcr：聚合酶链反应；fw：正向；rv：反向。
23.图11.患有遗传性神经病并携带sord中的双等位基因突变的患者的临床特征。
24.图12.受遗传性神经病影响并携带sord的双等位基因突变的患者的临床特征。如果所有个体或考虑的n/数量个体的数据可用，则分类数据表示为n(％)。连续变量表示为平均值
±
标准偏差(min-max)。cmt，腓骨肌萎缩症，dhmn，远端遗传性运动神经病。
25.图13.来自10名无关健康对照和10名携带sord中双等位基因p.ala253glnfster27突变的患者的血清空腹山梨糖醇水平。图表显示平均值
±
s.d.和数据分布(点)，以及比较组中sord蛋白和山梨糖醇水平的双尾t检验的p-值—*p《0.05、**p《0.01和***p《0.001。所有实验独立重复两次。
26.图14a-14c.sord基因替代疗法的示例性载体设计。(图14a)用于sord基因替代疗法的aav-9包装载体设计。cb7启动子已证明有效驱动高表达，接着是sord cdna(ncbi参考序列：nm_003104.6)、转录后调控元件(wpre)以进一步增强表达和靶标特异性以及转录终止poly(a)元件。进一步的复制起点(puc-ori)和itr序列(反向末端重复序列)。(图14b)sord cdna序列。(图14c)sord多肽序列。
27.图15a-15d.通过反义寡核苷酸(aso)(ar 1a,(seq id no:22))显著敲减醛糖还原酶(ar)(akr1b1基因)。靶向aso(ar 1a)序列和aso-s乱序序列(ar-s 1a，(seq id no：47))在图15a中示出。图15b示出对aso的核苷酸主链的修饰。这是在sord患者成纤维细胞和对照成纤维细胞中进行的，并针对β-微管蛋白标准化和通过蛋白质印迹测量(图15c-15d)。进一步对照是使用展示随机核苷酸的aso-s(ar-s 1a)的乱序版本(图15c)。
28.图16.反义寡核苷酸序列和人(homo sapiens)醛酮还原酶家族1成员b(akr1b1)中
的靶位点的表格，仅外显子靶标。过滤标准：a)40％《＝gc％《＝60％；b)反义寡核苷酸结合能《＝-8kcal/mol；c)靶序列中没有gggg。
29.图17.反义寡核苷酸(aso)序列和人醛酮还原酶家族1成员b(akr1b1)中的靶位点的表格，仅外显子靶标。过滤标准：a)40％《＝gc％《＝60％；b)靶序列中没有gggg；c)靶位点核苷酸的平均未配对概率》＝0.5；d)对于可及性分布(accessibility profile)中高于阈值概率0.5的每个峰，靶向这一相同峰的所有位点按其平均未配对概率(越高越好)进行排序，并且对于每个峰最多选择n个位点，其中n由max([峰宽/位点长度]，2)确定。e)在满足标准a-d的位点中，列出了平均未配对概率最高的前20个独特位点。
[0030]
图18.反义寡核苷酸(aso)序列和人醛酮还原酶家族1成员b(akr1b1)中的靶位点的表格，hg19_dna范围＝chr7:134127102-134143944(仅内含子靶标)。过滤标准：a)40％《＝gc％《＝60％；b)靶序列中没有gggg；c)靶位点核苷酸的平均未配对概率》＝0.5；d)对于可及性分布中高于阈值概率0.5的每个峰，靶向这一相同峰的所有位点按其平均未配对概率(越高越好)进行排序，并且每个峰最多选择n个位点，其中n由max([峰宽/位点长度]，2)确定；e)在满足标准a-d的位点中，列出了平均未配对概率最高的前20个独特位点
具体实施方式
[0031]
本公开提供了一种检测和/或治疗遗传性神经病和相关遗传病症的方法。
[0032]
遗传性(或遗传的)神经病包括但不限于腓骨肌萎缩症(cmt)、遗传性运动和感觉神经病、遗传性运动神经病、远端遗传性运动神经病(dhmn)、轴突神经病、中间型神经病(intermediate neuropathies)和肌萎缩侧索硬化型als4。
[0033]
在各种不同方面，本公开提供了一种方法，其中在来自受试者的样品中检测山梨糖醇脱氢酶(sord)基因中突变的存在。可以通过检验基因的dna序列、检验rna或检验具有导致某些功能丧失的突变的蛋白质来检测突变。
[0034]
本文公开了山梨糖醇脱氢酶基因(sord)中与cmt最常见隐性形式相关的双等位基因突变的鉴定。sord编码山梨糖醇脱氢酶，一种将山梨糖醇转化为果糖的酶。它属于两步多元醇途径，以前被认为对糖尿病的高血糖状态中的神经损伤是关键的。42例不同种族的cmt被鉴定为携带纯合或复合杂合状态的sord中的无义突变，c.757delg；p.ala253glnfster27。通过在另外的病例和多个对照集中筛选p.ala253glnfster27变化，该变体被确定为男性中根据孟德尔定律遗传的最常见的致病性等位基因之一(maf＝0.003)。患者成纤维细胞培养物显示sord蛋白的完全丧失以及细胞内山梨糖醇积累的损失，其导致组织损伤。果蝇中sodh1的缺失导致突触变性和进行性运动损害。值得注意的是，通过醛糖还原酶抑制剂处理减少多元醇内流完全挽救了患者成纤维细胞和sodh1果蝇模型中的细胞内山梨糖醇水平。在后一个模型中，处理也完全改善了运动和眼睛表型。总之，这些发现证明了多元醇途径和山梨糖醇积累在遗传性神经病中的重要作用，并在很大一部分病例中确定了潜在可治疗疾病的分子原因。这些发现也代表了将遗传性和获得性神经病的病理机制与在糖尿病领域的更广泛的影响汇集的一个例子。
[0035]
因此，在本公开的各种不同方面，所述方法包括检测sord基因突变753delg；p.(ala253glnfster27)，c.757delg；p.ala253glnfster27,c.28c》t；p.leu10phe,c.316_425+165del；p.cys106ter,c.329g》c；p.arg110pro,c.298c》t；p.arg100ter,c.295c》t；
p.arg299ter,c.964g》a；p.val322ile,c.458c》a；p.ala153asp；通过拷贝数目变异的单个或多个编码外显子或整个sord基因的缺失；或任何蛋白质截短突变和/或导致蛋白质“功能丧失”或亚效功能的突变。
[0036]
在各种不同方面，使用dna测序方法检测sord突变，例如全外显子组测序、全基因组测序(wgs)和/或下一代测序(ngs)、等位基因特异性寡核苷酸、聚合酶链反应(pcr)、定量或实时pcr(qpcr)、多重pcr、巢式pcr、突变阻滞扩增系统(arms)pcr、多重连接依赖性探针扩增(mlpa)、变性梯度凝胶电泳(dgge)、单链构象多态性(sscp)、蛋白质截断测试(ptt)、rflp、dna微阵列、rna-seq，使用基于crispr的突变检测(例如，crispr-chip,hajian et al.,nature biomedical engineering 3,427-437(2019))或其他适用于突变检测的dna或rna突变检测方法。
[0037]
在各种不同方面，通过使用蛋白质印迹法(免疫印迹)、高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱法(lc/ms)、抗体依赖性方法例如酶联法免疫吸附试验(elisa)、蛋白质免疫沉淀、蛋白质免疫染色、蛋白质芯片法或其他适合突变检测的蛋白质检测方法检验蛋白质来检测sord突变。
[0038]
任选地，所述方法还包括测量受试者样品中山梨糖醇的水平。测量山梨糖醇的方法包括例如酶促测定、荧光测定、基于色谱的方法和基于光谱的方法。实施例中提供了山梨糖醇测量的示例性方法。
[0039]
本公开还提供了表征神经病(例如，遗传性神经病)和涉及sord突变的相关病症的方法。在各种不同方面，所述方法包括测量患有神经病的受试者的生物样品中的山梨糖醇水平。在各种不同方面，所述方法包括检测生物样品中山梨糖醇的增加水平。
[0040]“山梨糖醇的增加水平”是指，例如，高于约10mg/l的山梨糖醇水平。如实施例和图13中所述，sord相关神经病导致患者体内山梨糖醇的高水平。因此，高于约10mg/l的山梨糖醇水平的检测表明该神经病是与sord突变相关的遗传性神经病，从而允许临床医生鉴定困扰该受试者的神经病。任选地，所述方法包括治疗步骤，该治疗步骤包括向受试者施用选自以下的药剂：醛糖还原酶抑制剂；醛糖还原酶反义寡核苷酸；编码sord肽的多核苷酸；sord肽；阻断突变sord基因表达的药剂；以及纠正sord基因中的突变的药剂。
[0041]
在各种不同方面，本公开提供了一种方法，该方法包括在测量受试者的山梨糖醇水平的步骤之前或之后鉴定来自受试者的样品中山梨糖醇脱氢酶(sord)基因中的突变。在这一点上，所述方法可用于确认遗传性神经病的诊断。类似地，本公开提供了一种用于鉴定致病性sord突变的方法，该方法包括测量包含sord基因中的突变的受试者中的山梨糖醇水平。升高的山梨糖醇水平(例如，大于约10mg/l)的存在表明sord突变是致病性的。
[0042]
或者(或另外地)，所述方法可用于评估治疗受试者的遗传性神经病的功效。在这一点上，所述方法包括对受试者进行治疗，然后测量生物样品中的山梨糖醇水平。与治疗前观察到的山梨糖醇水平相比，山梨糖醇水平的降低(例如，山梨糖醇水平降低至低于约10g/l)表明受试者的状况有所改善。本文描述的材料和方法还可以表征患者在服用治疗sord相关遗传性神经病的药物时的依从性或在临床试验中监测候选治疗剂的成功。
[0043]
样品可以是取自受试者的任何生物样品，包括但不限于可以分析感兴趣的特性，例如核酸(例如，sord mrna)、蛋白质(例如，sord蛋白)或山梨糖醇的存在或量，的任何组织、细胞或流体(例如，血液、血浆、血清或尿液)。在各种不同实施方案中，所述生物样品是
血浆、血清、唾液、尿液或皮肤样品。
[0044]
如本文所指的“受试者”可以是任何哺乳动物，例如人类。考虑了具有农业重要性的动物，例如牛、马和猪科动物，以及作为家养宠物重要的动物，包括犬科动物和猫科动物；研究中重要的动物，包括啮齿动物和灵长类动物；以及大型濒危物种和动物园动物，例如灵长类动物、猫科动物、长颈鹿、大象、犀牛。
[0045]
在各种不同方面，所述方法包括通过向受试者施用包含一种或多种醛糖还原酶抑制剂的组合物来治疗受试者。在一些实施方案中，醛糖还原酶抑制剂是阿瑞司他、依帕司他、地帕司他、非达司他、伊米司他、利多司他、米那司他、波那司他、雷尼司他、salfredin b
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、索比尼尔、托瑞司他、泽那司他或佐泊司他。醛糖还原酶抑制剂在expert opin ther pat.2019；29(3):199-213；chatzopoulou et al.,expert opin ther pat.2012；22(11):1303-23中进行了综述(以全文引用的方式并入本文)。
[0046]
在一些实施方案中，采用酶替代疗法，并且向受试者施用sord肽。因此，当内源性sord水平不足或不存在时，该疗法补充sord肽水平。示例性sord肽在seq id no:46中提供。本公开考虑使用包含与seq id no:46的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的肽。
[0047]
在各种不同实施方案中，所述方法包括向受试者施用多核苷酸(例如醛糖还原酶反义寡核苷酸、编码sord肽/蛋白质的多核苷酸、阻断突变sord基因表达的药剂和/或纠正sord基因中的突变的药剂)。多核苷酸通常通过表达载体递送至宿主细胞，该表达载体包括递送和表达所必需的调控序列，尽管在本公开的情况中不是必需使用表达载体。在一些方面，本文所述的构建体包括启动子(例如，巨细胞病毒(cmv)启动子或cb7启动子)、蛋白质编码区(任选地具有促进表达的非编码(例如3'-utr)区)、转录终止序列和/或调控元件序列(例如，转录后调节元件(wpre)、poly(a)元件、复制起点(puc-ori)和/或itr序列(反向末端重复))。在各种不同方面，本文所述的构建体包括表1中列出的一种或多种载体特征。载体特征在powell等人.,discov med.2015；19(102):49-57中进行了综述(以全文引用的方式并入本文)。举例来说，cre-loxp系统可用于表达感兴趣的肽(例如，sord肽，任选地在感兴趣的特定组织中)。表达载体可以是基于病毒的(例如，基于逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒)或非病毒载体(例如，质粒)。也可以采用非基于载体的方法(例如，使用裸dna、dna复合物等)。任选地，载体是病毒载体，例如慢病毒载体或杆状病毒载体，并且在各种不同优选实施方案中，载体是腺相关病毒载体(aav)。表达载体可以基于任何aav血清型，包括aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12或aav-13。多核苷酸也可以通过脂质体、纳米颗粒、外泌体、微囊泡、基于流体动力学的基因递送或通过“基因枪”递送。
[0048][0049]
表1：载体特征元件
[0050]
在本公开的方法中施用的aav的滴度将根据例如特定的aav、施用模式、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域已知的方法确定。aav的滴度可在每ml约1x106、约1x107、约1x108、约1x109、约1x10
10
、约1x10
11
、约1x10
12
、约1x10
13
至约1x10
14
或更多dnase抗性颗粒(drp)的范围内。剂量也可以以病毒基因组(vg)的单位表示。
[0051]
在各种不同实施方案中，向受试者施用编码sord肽的多核苷酸。sord的氨基酸序列提供为seq id no：46(图14c，ncbi参考序列：np_003095.2)。所述方法中使用的多核苷酸任选地编码seq id no:46的氨基酸序列或与seq id no:46的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的序列(其保留sord的功能)。任选地，多核苷酸包含seq id no:45(图14b)或与seq id no:45的多核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的序列(并且其编码sord)。图8和14a示出了包含编码sord肽的多核苷酸的示例性表达载体。在本公开的至少一个方面，多核苷酸包含图9中所示的核酸序列(seq id no：1)，其对应于包含编码sord的多核苷酸的aav载体的序列。
[0052]
在各种不同实施方案中，所述方法包括向受试者施用阻断突变sord基因表达的药剂。阻断突变sord基因表达的药剂是指干扰sord基因的表达从而使sord基因表达和/或sord蛋白水平与基础/野生型水平相比降低的药剂。应当理解，“阻断”突变sord基因的表达不需要100％消除表达和sord产生；任何水平的异常sord的表达降低可能对受试者是有益的。示例性药剂包括但不限于反义寡核苷酸(aso)、短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)或微rna(mirna)。
[0053]
在各种不同实施方案中，所述方法包括向受试者施用靶向醛糖还原酶序列的醛糖还原酶反义寡核苷酸，使得酶的表达被阻断。醛糖还原酶，醛酮还原酶家族1成员b(akr1b1)，由seq id no:48(ncbi参考序列:nm_001628)编码。醛糖还原酶反义寡核苷酸干扰醛糖还原酶基因(akr1b1)的表达，因此与基础/野生型水平相比，akr1b1基因表达和/或醛糖还原酶蛋白水平降低。应当理解，“阻断”醛糖还原酶基因(akr1b1基因)的表达不需要100％消除表达和醛糖还原酶产生；任何水平的醛糖还原酶表达降低可能对受试者有益。举例来说，在各种不同方面，降低醛糖还原酶表达的醛糖还原酶反义寡核苷酸。aso是一种单链脱氧核糖核苷酸，其与mrna靶序列互补。在各种不同方面，醛糖还原酶反义寡核苷酸靶向醛糖还原酶基因的外显子或内含子序列。
[0054]
在用于鉴定靶向醛糖还原酶的aso序列的示例性方法中，使用以下标准：a)选择靶向醛糖还原酶(akr1b1)的序列，其包含《＝40％gc或《＝60％gc含量；b)排除含有gggg核苷酸的序列；c)选择靶位点核苷酸的平均未配对概率》＝0.5的序列；d)对于可及性分布中高于阈值概率0.5的每个峰，靶向同一峰的所有位点按其平均未配对概率(越高越好)进行排序，并且每个峰最多选择n个位点，其中n由峰宽度/位点长度的最大值确定。满足这些标准的示例性药剂在表2中提供。另外的示例性aso序列和过滤标准显示在图16-18中。
[0055]
[0056]
表2：靶向akr1b1/醛糖还原酶的aso序列
[0057]
在各种不同实施方案中，将aso序列的核苷酸主链修饰为嵌合或gapmer设计以与基础/野生型水平相比减少基因表达。在各种不同实施方案中，gapmer设计需要在反义寡核苷酸序列的每一末端指定3-5个核苷酸以在核糖部分中携带对rnase h识别和其他核酸酶具有抗性的修饰，而同时所有其他核苷酸含有rnase h相容的修饰。rnase h负责切割rna-dna双链体，例如在异常mrna转录本和合成设计的dna反义寡核苷酸之间形成的双链体。在各种不同实施方案中，对aso序列的修饰包括但不限于硫代磷酸酯(ps)-rnase h可识别、磷酰二胺吗啉代(pmo)-抗rnase h、2'-o-甲基-抗rnase h、2'-o-甲氧基乙基(moe)-抗rnase h、锁核酸(lna)-rnase h抗性、乙烯桥接核酸(ena)-抗rnase h或(s)-约束乙基(cet)-抗rnase h。aso序列的示例性修饰在图15a-15b中示出。aso序列的修饰在scoles等人,neurol genet.2019；5(2):e323中进行了综述(以全文引用的方式并入本文)。
[0058]
在各种不同方面，所述方法采用rna干扰(rnai)来调节sord的表达。rnai途径在duan(ed.),muscle gene therapy,springer science+business media,llc(2010)第7章第7.3节中进行了总结。合适的药剂包括例如sirna、mirna和shrna。shrna/发夹载体是一种具有紧密的发夹转角的人工rna分子(核苷酸)，其可用于通过rnai使靶基因表达沉默。shrna是rnai的有利的介体，因为它的降解和周转率相对较低，但它通常需要使用表达载体。在示例性方面，本公开包括表达一种或多种靶向sord的shrna的aav载体的产生和施用。shrna的表达通过使用各种启动子来调控。在各种不同方面，使用聚合酶ii启动子，例如u6和h1，以及聚合酶iii启动子。在一些方面，使用u6 shrna。应当理解，rnai也可用于下调(即阻断)醛糖还原酶(例如，akr1b1)的表达，因此本公开考虑使用靶向醛糖还原酶内含子或外含子序列的sirna、mirna和shrna来阻断醛糖还原酶的表达。
[0059]
传统的小/短发夹rna(shrna)序列通常在细胞核内从含有pol iii启动子如u6的载体转录。内源性u6启动子通常控制u6 rna(一种参与剪接的小rna)的表达，并且已被充分表征(kunkel等人,nature.322(6074):73-7(1986)；kunkel等人,genes dev.2(2):196-204(1988)；paule等人,nucleic acids res.28(6):1283-98(2000))。本公开包括鼠和人u6或h1启动子。含有通过环连接的来自靶基因的有义和反义序列的shrna从细胞核转运到细胞质中，在那里dicer将其加工成sirna。
[0060]
在本公开的一些方面，使用了纠正sord基因中的突变的药剂。纠正sord基因中的突变的药剂是指能够修饰sord编码序列或与sord基因相关的调控元件和/或非编码区以实现序列中所需的改变的药剂。在各种不同方面，基因组编辑可用于替换部分或全部sord基因序列或改变sord蛋白表达水平。在各种不同实施方案中，所述药剂可包含在基因组编辑技术中采用的组分，例如设计者锌指(designer zinc fingers)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)或crispr-cas(成簇的规律间隔短回文重复序列-crispr相关)系统。用于本公开的方法的示例性药剂是编码cas9分子和/或grna分子的dna。cas9和grna可以存在于单一表达载体或单独的表达载体中。crispr/cas9系统的腺病毒递送在holkers等人，nature methods(2014),11(10):1051-1057中进行了描述，该文献以全文引用的方式并入本文。
[0061]
其他描述crispr系统和cas9的公开出版物包括以下：cong等人.science(2013)339:819-23；jinek等人.elife.(2013)2:e00471；lei等人，cell(2013)152:1173-1183；gilbert等人.cell(2013)154:442-51；lei等人.elife(2014)3:e04766；perez-pinela等
人.nat methods(2013)10:973-976；maider等人.nature methods(2013)10,977-979；美国专利第8,697,359号；美国专利第8,771,945号；美国专利第8,795,965号；美国专利第8,865,406号；美国专利第8,871,445号；美国专利第8,889,356号；美国专利第8,895,308号；美国专利第8,906,616号；美国专利第8,932,814号；美国专利第8,945,839号；美国专利第8,993,233号；美国专利第8,999,641号；美国申请公开第2014/0068797号；和国际专利公开第wo 2014/197568号，均通过全文引用的方式并入本文。
[0062]
在一些实施方案中，crispr/cas9多重可用于靶向多个基因组位点，其中两个或多个指导rna如crispr 101:a desktop resource(第1版),addgene,2016年1月中所述进行表达，该文献通过全文引用的方式并入本文。
[0063]
术语“治疗(treating)”或“处理(treatment)”是指减少或改善遗传性神经病和/或相关障碍和/或与其相关的症状。这些术语包括减少或延迟神经病变或与其相关的症状的发生或复发的频率(即，延长患有该障碍的患者的缓解期)，以及降低该障碍或与之相关的任何症状的严重程度。应当理解，尽管不排除，障碍或病症的治疗(treating)”或“处理(treatment)”并不要求完全消除障碍、病症或与其相关的症状。
[0064]
活性剂(例如，醛糖还原酶抑制剂、醛糖还原酶反义寡核苷酸、编码sord肽的多核苷酸、sord肽、阻断突变sord基因表达的药剂或纠正sord基因中的突变的药剂)的剂量将取决于诸如施用途径(例如，局部与全身)、患者特征(例如，性别、体重、健康、副作用)、遗传性神经病或相关障碍的性质和程度以及选择用于给药的特定活性剂或活性剂组合的因素。
[0065]
本文所述的活性剂以组合物(例如，药学上可接受的组合物)的形式提供，该组合物可包含适合施用于受试者的制剂组分以及另外的治疗剂。施用生理学可接受的组合物(例如包含本文所述的药剂的药物组合物)的合适方法是本领域公知的。在各种不同方面，可以使用多于一种途径来施用一种或多种本文公开的药剂。与其他途径相比，特定途径可以提供更直接和更有效的反应。例如，在某些情况下，需要口服递送组合物；通过静脉内、腹腔内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方式注射或输注；通过控制、延迟、持续或以其他方式改良的释放系统；通过植入装置；使用纳米颗粒；或作为缀合物。
[0066]
预期本文所述的两种或更多种活性剂可作为治疗方案的一部分施用。或者或另外地，一种或多种活性剂可以与其他治疗剂一起作为治疗方案的一部分给药。所述活性剂可作为单一疗法或作为与同时或节律性施用的其他疗法的组合疗法施用。术语“同时的”或“同时地”是指在六小时或更短的时间内(例如，彼此三小时内或一小时内)施用两种药剂。在这一点上，多个活性(或治疗性)药剂可在短时间内(例如，30分钟内)以相同组合物或单独组合物施用。术语“节律性”是指在不同时间和以与重复施用相关的频率施用不同的药物。活性剂无需同时或通过相同途径施用；优选地，在各种不同实施方案中，不同活性剂发挥其治疗作用的时间段存在重叠。本公开的其他方面和细节将从以下实施例中明确，这些实施例旨在说明而非限制。
[0067]
实施例
[0068]
通用方法
[0069]
家族
[0070]
所有家族提供了参与研究的书面知情同意书。研究方案得到了给定机构的伦理审
查委员会的批准。所有患者均由神经科医生进行临床评估。
[0071]
全外显子组和sanger测序
[0072]
在来自散发性和隐性cmt和dhmn家族的索引个体(index individuals)中进行全外显子组测序。sureselect human all exon 50mb试剂盒(agilent)用于溶液内富集，hiseq 2500仪器(illumina)用于产生约120bp的末端配对序列阅读片段。burrows-wheeler aligner和freebayers用于比对序列阅读片段和调用变体。最终数据上载到genesis软件进行分析。在数据库中的所有外显子组上应用了一种过滤方法来搜索共有相同纯合变体的家族。由eurofins genomics进行的sanger测序证实了sord变体的分离。聚合酶链反应(pcr)在veriti thermocycler(applied biosystem)中进行，platinum taq(thermofisher)用于扩增含有目标突变的区域。以下引物用于特异性靶向sord而不是sor2p(图10)。
[0073]
成纤维细胞培养
[0074]
成纤维细胞获自患者并在补充有10％胎牛血清(fbs)、青霉素和链霉素(gibco)的dulbecco's modified eagle培养基(thermofisher)中培养。细胞保持在37℃，5％co2的加湿培养箱中。异步细胞培养物生长到大约80％的汇合度，并用依帕司他(100μm)、雷尼司他(10μm)或dmso处理72小时。含有药物或dmso的培养基每24小时更换。
[0075]
蛋白质印迹
[0076]
在含有蛋白酶抑制剂(roche)的ripa缓冲液(thermofisher)中裂解成纤维细胞，并使用bioruptor超声装置(diagenode)超声处理5分钟。细胞裂解物在4℃下以13000x g离心10分钟，并收集上清液进行蛋白质定量(pierce bca蛋白质分析试剂盒)。将30μg蛋白质样品与bolt lds样品缓冲液和样品还原剂(thermofisher)混合，并在90℃下加热5分钟。将样品装载在bolt 4-12％bis-tris plus迷你凝胶上，然后转移到硝酸纤维素膜(bio-rad)中。用5％脱脂牛奶封闭膜，并用抗sord(ab189248，abcam)抗体孵育2小时，用含有0.01％吐温20(bio-rad)的tbs洗涤，并用二级抗兔抗体(cell signalling)孵育。膜随后与gapdh一级抗体(santa cruz)和二级抗小鼠抗体(cell signalling)一起孵育。使用supersignal west pico plus化学发光底物进行化学发光检测，并使用fluorchem e(proteinsimple)成像。
[0077]
山梨糖醇测量
[0078]
在没有蛋白酶抑制剂的情况下，按照western blot部分所述进行成纤维细胞的收集与裂解。采用超高效液相色谱-串联质谱法(uplc-ms/ms)(waters acquity uplc&tqd质谱仪-waters，美国马萨诸塞州米尔福德)测定人成纤维细胞裂解物中的山梨糖醇。在没有蛋白酶抑制剂的情况下，按照western blot部分所述进行成纤维细胞的收集与裂解。蛋白酶抑制剂含有高浓度甘露醇，甘露醇是山梨糖醇对映体，并可能干扰uplc-ms/ms山梨糖醇的测定。在注射到uplc(3μl)中之前，裂解物样品用乙腈(1:5)沉淀蛋白质，用乙腈-水(50/50)10倍稀释，并在oasis hlb盒(10mg/1ml)上清洗。uplc条件：柱，88℃下的beh amide 1.7μm(2.1x 100mm)，洗脱液a，乙腈90％-水5％-异丙醇5％，洗脱液b，乙腈80％-水20％，梯度洗脱0min 100％a，3.6min 100％b，流速，0.45ml/min。山梨糖醇的保留时间为2.7min。ms/ms条件：接口，负离子模式的电喷雾接口，多反应监测采集，m/z 180.9
→
88.9(cv 24,ce 15)。
[0079]
对于空腹山梨糖醇水平测试，在过夜禁食(前一晚最后一顿饭)后在血清分离管中
采集血液。样品在500g下离心10min。血清在采血后一小时内分离并冷冻。山梨糖醇水平使用从li等人.biochem biophys res common.2009年10月2日；387(4):778-83改编的方法通过uplc进行测试。条件如下：柱，beh amide 1.7μm，保持在25℃(而不是45℃)；洗脱液a，10mm醋酸铵ph10；洗脱液b，乙腈。流速，0.6ml/min,具有20相同梯度。山梨糖醇的保留时间为6.0min。ms/ms条件与成纤维细胞分析相同。血清样品用冷甲醇(1:5)沉淀蛋白质，用乙腈-水(50/50)稀释五倍，并在oasis hlb盒(10mg/1ml)上清洗，然后注入uplc中(3μl)。校准曲线在山梨糖醇浓度范围0.1-20mg/l内在血清中完成。
[0080]
果蝇种群与遗传学
[0081]
除非另有规定，否则所有苍蝇均在25℃、65％湿度的玉米粉-糖蜜-酵母培养基上，以12h光照/12h黑暗循环保持。本研究中使用的以下苍蝇品系获自布卢明顿果蝇饲养中心:elav
c155-gal4,gmr-gal4,sdh2
mb01265
,uas-sdh1rnai和uas-sdh2rnai。
[0082]
喂药
[0083]
将依帕司他或雷尼司他溶解在二甲基亚砜(dmso)中，以达到10mg/ml的储备液浓度，然后以80μg/ml的最终浓度混合到10ml的蝇类食物中。作为对照，将等量的dmso混合到蝇类食物中。喂食前，将小瓶在室温下干燥12小时。
[0084]
果蝇寿命测定和负趋地性测定
[0085]
为进行寿命测定，收集每组100只新围住的雌性苍蝇，并将其放入20只个体的小瓶中。每2天将苍蝇转移到新的小瓶中，并统计死苍蝇的数量。使用kaplan-meier曲线绘制生存数据，并使用对数秩检验进行组间比较。对于负趋地行为分析，将10只年龄匹配的雌性苍蝇放入在底部上方8厘米处标有水平绘制的黑线的小瓶中。给苍蝇60min从二氧化碳麻醉中完全恢复，并轻轻地拍打底部和给10s来攀爬。对穿过8cm线的苍蝇进行计数。对于每个小瓶，重复该测定10次，并对每组的10个独立小瓶(每组共100只苍蝇)进行测试。为了最小化观察者期望偏差，该测定是在检查员对组分配不知情的情况下进行的。
[0086]
果蝇脑解剖、免疫染色和共焦显微分析
[0087]
如前所述(brazill等人,j vis exp.2018；(138))进行脑解剖和染色。简而言之，在磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph 7.4)中解剖苍蝇脑，在4％甲醛中固定10min，并在pbtx(含有0.4％v/v triton x-100的pbs)中洗涤3次(每次15分钟)。然后将脑与在0.4％pbtx和5％正常山羊血清中以1:250稀释的一级小鼠抗brp抗体(nc82，developmental studies hybridoma bank)，在4℃下伴随轻轻摇动孵育过夜。之后，将脑与1:250稀释度的cy3偶联的抗小鼠二抗(rockland)和cy5偶联的抗hrp(jackson immunolab)在4℃下伴随轻轻摇动孵育过夜，随后在室温下4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，1:300，invitrogen)染色10min。样品用vectashield antifade封片介质(vector laboratories inc.)装载在载玻片上。使用带有60
×
油浸物镜的olympus ix81共焦显微镜成像，扫描速度为每像素8.0μs，空间分辨率为1024
×
1024像素对苍蝇脑玻片进行成像。使用fluoview 10-asw(olympus)对图像进行处理和分析。
[0088]
本公开的其他方面和细节将从以下实施例中明确，这些实施例旨在说明而非限制。
[0089]
实施例1：使用genesis分析鉴定cmt中的dna变体
[0090]
遗传性神经病，包括腓骨肌萎缩症(cmt)，代表影响外周神经的临床和遗传异质病
症的伞式概念。cmt根据传导速度分为脱髓鞘(cmt1)和轴突(cmt2)型。远端遗传性运动神经病(dhmn)代表cmt2的一种形式，其中疾病负荷主要或完全落在运动神经上(rossor,tomaselli和reilly 2016)。与超过90％的病例具有已知基因中的突变的cmt1相反，只有20％到30％的cmt2和远端hmn患者接受基因诊断(fridman等人，2015年)。由于多达70％的cmt2和dhmn病例是散发性的，因此从单个病例全外显子组和基因组序列中识别候选致病基因变得更具挑战性；因此，大型集合数据集是必要的。使用genesis分析平台上可用的超过1,100个cmt全外显子组测序(wes)和全基因组测序(wgs)的数据聚合提供了可用的此类高质量数据的最大集合(gonzalez等人，2015年)。鉴定了在多个家族中存在的具有显著dna变体的基因，以及在cmt病例中过度表现的单个等位基因。当查询598名未诊断cmt患者的子集，以确定》3个家族共有的以及gnomad对照数据库中具有《1％的次要等位基因频率的基因中的隐性无义变体时，从11个携带sord中的纯合c.757delg；p.(ala253glnfster27)突变的无关家族中鉴定出12个病例。来自三个无关家族的另外四个病例携带杂合c.757delg；p.(ala253glnfster27)变体以及和第二变体，家族2中的c.298c》t；p.(arg100ter)，家族3中的c.329g》c；p.(arg110pro)和家族14的ii-1和ii-2中的c.458c》a；p.(ala153asp)(图1a-d和图5)。除c.329g》c；p.(arg110pro)外，所有突变代表功能丧失(lof)等位基因；有趣的是，arg110pro的变化与先前报道的tyr111phe(对应于大鼠中的tyr110phe)邻近，后者被证明消除sord酶活性并使蛋白质失稳定(hellgren等人，2007年)。
[0091]
有趣的是，sord具有非功能性的高度同源旁系同源物，假基因sord2p，它被认为是由15号染色体上0.5mb区域内的sord重复产生的(carr等人.2016)(图1e)。为了特异性扩增sord而不是sord2p，在sanger确认研究中，设计了利用核苷酸序列差异和两者基因区域中不同的逆转录转座子插入的引物(图5)。值得注意的是，在超过95％的对照染色体中，sord的外显子7中的c.757delg；p.(ala253glnfster27)突变被固定在假基因sorp2p中，以及许多额外的外显子indel突变，其阻止sopr2p的有效翻译(1000genomes project consortium等.2015；lek等人.2016)。由于区域的高度相似性，有必要采用巢式pcr方法获得sord外显子7的特异性扩增，并将其与sord2p中的同源区域区分开来。在所有病例中，通过sanger测序证实了wes检测的变体的存在，并提供了直系亲属携带者的分离数据(图1f和图5)。
[0092]
在(伦敦(英国)的ucl神经病学研究所)筛选了一组独立的103个未解析的cmt2/dhmn病例wes。来自六个无关家族的九个病例被确定为携带sord中的纯合c.757delg；p.(ala253glnfster27)突变(8.7％)。第三个独立的297名隐性或散发性cmt2/dhmn患者的组通过sord外显子7的靶向sanger测序进行筛选，如果鉴定了一个c.757delg；p.(ala253glnfster27)，则将其扩展到其他编码外显子，并从sord中具有双等位基因突变的18个家族发现另外20个病例(7％)：16例具有纯合c.757delg；p.(ala253glnfster27)突变和4例具有与第二可能致病性变体的复合杂合状态中的c.757delg；p.(ala253glnfster27)突变。后者包括家族29中的c.964g》a；p.(val322ile)；家族30中的外显子4中的275bp缺失c.316_425+165del；家族32中的de novo c.28c》t；p.(leu10phe)，及家族33中的c.895c》t；p.(arg299ter)。在gnomad中，所有变化具有《0.0001的次要等位基因频率(maf)(lek等人.2016)。受错义突变影响的残基在多个物种中高度保守(图1d)，gerp评分大于3。此外，在genesis数据库中存在的受cmt之外的不同神经系统障碍影响的4,598个索引病例(index cases)中不存在sord中的双等位基因无义变异。
[0093]
基于gnomad基因组中30,872中94的等位基因计数,正常人群中c.757delg；p.(ala253glnfster27)变体的等位基因携带者频率为0.003％(lek等人，2016年)。值得注意的是，由于未能通过随机森林过滤(random forest filters)，gnomad外显子组集合以maf＝0.00008的显著较低的频率检测到c.757delg；p.(ala253glnfster27)改变。genesis使用freebayes软件进行变体调用(gonzalez等人.2015)，其可能导致等位基因频率更接近基于gnomad基因组的调用集(maf
genesis
＝0.002,9,196个中的22个)。对600名健康对照进行了sanger测序，其中包括200个欧洲人样品、100个土耳其人样品和200个中东血统的人的样品，并确定了三个杂合的，但没有纯合的，c.757delg；p.(ala253glnfster27)等位基因(maf＝0.0025)。这些计算支持大约1/100,000个体的纯合c.757delg；p.(ala253glnfster27)等位基因的估计流行率，使其成为轴突神经病中最常见的单个致病等位基因及任何孟德尔疾病的最常见的等位基因之一。
[0094]
在本研究中来自38个无关家族的总共45个受遗传性神经病影响的个体被鉴定为携带sord中的双等位基因突变(图11和12)。值得注意的是，71％的病例是散发的，没有家族史或血缘关系的证据。正式的临床诊断为51％(n＝16)的轴突cmt，40％(n＝18)的远端hmn，以及9％(n＝4)的中间型cmt病例。神经病的平均发病年龄为17
±
8岁，行走困难是发病时最常见的主诉。延迟的运动发育标志并不常见，但三分之二的患者报告了足变形，这表明神经病变可能在生命早期开始。首次检验时，所有个体具有四肢无力，但只有一半表现出感觉障碍。远端上肢无力轻度，和远端下肢轻度至近乎完全瘫痪。上肢和下肢的近端肌肉通常不受影响。7名患者有上肢震颤，4名患者有轻度脊柱侧弯，2名患者有轻度听力损失。1例具有同时且可能无关的综合征性紊乱，包括变形特征，自3岁起的非进行性智力低下，和痉挛性共济失调，伴有脑部mri的小脑萎缩迹象。没有患者患有白内障或牵涉其他器官。根据cmt神经病评分，67％(n＝30)中神经病变为轻度，31％(n＝14)为中度，1例为重度。42％的患者(n＝19)在行走时需要踝足矫形器来支撑足部，一名患者需要单侧支撑，一名患者依赖轮椅。对42名患者进行了详细的神经传导研究，均显示运动轴突性神经病变，26％(n＝11)中传导速度中度降低，26％(n＝65)中感觉动作电位降低。
[0095]
实施例2：评估人成纤维细胞中的sord蛋白表达和血液中的sord水平
[0096]
山梨糖醇脱氢酶是38-kda亚基的同型四聚体酶，广泛分布于哺乳动物组织中(johansson等人.2001；hellgren等人.2007；lindstad,teigen和skjeldal 2013)。它代表两步多元醇途径的第二个酶，其中葡萄糖被醛糖还原酶(ar)转化为山梨糖醇，一种相对不易代谢的糖。然后山梨糖醇被sord氧化成果糖(图2a)。为了进一步深入了解sord中的隐性突变的功能性后果，接下来评估了来自五个不相关的受影响个体以及两个未受影响的杂合状态c.757delg；p.(ala253glnfster27)的携带者的成纤维细胞中的sord表达，这些受影响个体具有纯合c.757delg；p.(ala253glnfster27)(n＝4)或c.757delg；p.(ala253glnfster27)&c.895c》t；p.(arg299ter)(n＝1)变体。所有患者中不存在sord蛋白，且与对照相比，未受影响的携带者中野生型水平降低(图2b)。因此，与对照相比，患者成纤维细胞中的细胞内山梨糖醇浓度高出10倍以上，这与sord酶活性的丧失保持一致(图2c)。测定了10名携带纯合p.ala253glnfster27突变的患者和10名不相关对照的血清中的空腹山梨糖醇水平，发现其高出100倍(14.82
±
0.780vs 0.046
±
0.004mg/l，p《0.0001)，证实了患者缺乏sord酶活性(图13)。该研究还表明，山梨糖醇是检测或表征哺乳动物受试者中与
sord突变相关的遗传性神经病的有用标志物。
[0097]
实施例3：在sord缺陷模型中研究sord突变
[0098]
为了进一步探究体内sord突变的病理生理学，建立了sord缺陷的黑腹果蝇模型。果蝇有两个功能性sord基因(sodh1和sodh2)，它们具有90％的残基同一性(luque等人，1998)。sord在远缘门(distant phyla)中是保守的，且果蝇sodh1(np_001287203.1)和sodh2(ncbi参考序列:np_524311.1)编码的蛋白质与人类sord蛋白(ncbi参考序列:np_003095.2(seq id no:46))分别具有75％和73％的同一性。获得sodh2的突变等位基因，其中基因通过转座子minos介导的整合子盒(mimic)插入(sodh2
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)破坏(bellen et al.2011)。纯合sodh2(sodh2
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)突变体可以正常寿命存活。为了表征神经变性表型，使用果蝇视觉系统以利用复眼的高度组织的平行轴突，其允许在体内检测细微的神经元和突触病理变化(bausenwein,dittrich和fischbach 1992)。外部光感受器轴突的轴突横穿过神经板皮质(lamina cortex)，并与神经板层中的神经板单极神经元形成突触连接(图3a)。在羽化后2天(dae)的对照果蝇(yw)中，可分别在xy-和xz-平面上观察到光感受器突触的组织化神经板筒(图3b)。在羽化后2天(dae)，观察到sodh2
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突变体的神经板层中光感受器末端的丧失(图3c)。该表型在10dae时逐渐变得严重，空泡更多且尺寸更大，分布在整个突触神经板层中(图3c、d)。这些空泡表现出神经元膜的丧失(通过hrp标记标出)，以及bruchpilot(brp，一种突触活性区细胞质基质蛋白)标记的减少，表明突触变性(图3c、d)。为了验证本文所述的发现，使用泛神经元驱动子elav
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通过神经元中的sodh1和sodh2表达的特异性敲减生成了第二sord模型。sodh1和sodh2的丧失导致年龄相关性突触变性，与纯合sodh2(sodh2
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)的突触变性相似(图6)。表征了sord缺陷的行为表型具有sodh2中系统性功能丧失的sodh2
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纯合苍蝇，尽管这些苍蝇表现出正常的寿命，但它们的自发活动在后期(40dae)显著受损(图3e、f)。这表明让人联想到遗传性神经病的进行性的、年龄相关性的神经肌肉功能障碍。此外，在10dae时在苍蝇头部中测量山梨糖醇水平，并观察到sodh2
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模型中的显著增加(图4b)，这与患者成纤维细胞中的观察结果一致。总之，成功建立了sord缺陷的果蝇模型，该模型重演了人类患者的典型病理表型，包括(1)正常寿命，(2)进行性和年龄相关性突触变性和运动缺陷，以及(3)山梨糖醇水平升高。
[0099]
在确定功能丧失作为作用机制和已知酶途径之后，研究了sord相关遗传性神经病的治疗选择。先前已经表明，醛糖还原酶(sord上游的酶)的药理抑制代表了减少糖尿病细胞和动物模型中毒性山梨糖醇积累的成功策略(kikkawa等人.1983；matsumoto等人.2008；ramirez和borja 2008；hao等人.2015；grewal等人.2016)并且，也可以说是人类中的成功策略(chalk,benstead和moore 2007；polydefkis等人.2015；sekiguchi等人.2019)。测试了两种市售醛糖还原酶抑制剂(ari)，依帕司他和雷尼司他，对缺乏功能性sord的患者成纤维细胞中细胞内山梨糖醇积累的影响。在存在或不存在依帕司他(100μm)或雷尼司他(10μm)的情况下，患者和对照成纤维细胞生长72小时，然后测量细胞内山梨糖醇水平。两种ari，依帕司他和雷尼司他，都实现了山梨糖醇的显著降低，达到与对照相当的水平(图4a)。此外，sord的果蝇模型从2dae开始喂药依帕司他和雷尼司他。在10dae时的sodh2
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苍蝇头部中观察到山梨糖醇水平显著降低(图4b)。重要的是，sodh2
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苍蝇和具有sodh1和sodh2的神经元特异性敲减的苍蝇的自发活动被挽救达到yw对照苍蝇的水平(图
diabetes investigation 10(2):466-74.