专利名称：用亲合色谱法提纯水蛭素的方法
技术领域：
本发明涉及的是水蛭素的提纯方法，更具体地说涉及的是用亲合色谱法提纯水蛭素的方法。
由水蛭、医用水蛭中分离出的水蛭素是一种凝血酶抑制剂，它由65-66个氨基酸组成。已公知有约11种水蛭素变体，根据N-末端氨基酸序列将它们分成两组N-末端氨基酸为Val-Val(Bagdy等，Meth.Enzymol.45，669(1976))的HV1和N-末端氨基酸为Ile-Thr(Walsmann & Markwardt，Thromb.Res.40，563(1985))的HV2。HV1和HV2两者都已用于治疗血栓形成。水蛭素表现的凝血酶抑制常数(Ki)为10-11M至10-14M，这表明水蛭素能以很低的浓度抑制血液凝结(Mao等，Anal.Biochem.161，514(1987))。特别是，临床试验证明水蛭素没有如过敏、免疫反应、循环机能变常的副作用(Markwardt等，Thromb.Haemostas，52，160(1984))。
由一个医用水蛭中可获得的水蛭素的量少至20μg(Markwardt，Meth.，Enzymol.，19，924，1970)。因而，已有许多偿试以通过培养遗传工程微生物来大量生产水蛭素(作为综述，可参见Fareed等，Blood coagulation and Fibrinolysis，2，135(1991))。
Riehl-Bellon等采用阴离子交换色谱法和反相HPLC来提纯通过基因克隆技术生产的水蛭素(Riehl-Bellon等，Biochem.，28，2941(1989))。Misawa等在DEAE-Cellulofine、Butyl-Toyopearl、Sephadex G-25和Q-Sepharose上依次进行柱色谱法来从重组体E.coli培养物中提纯HV2(Misawa等，Proceeding of ApBiochEC.P.62(1992))。
然而，开发出的这些方法仅用来检测宿主细胞中产生的水蛭素，不适合应用于水蛭素的定量提纯。
采用注射剂型的医用重组体蛋白质应是高度纯化的，从制品的安全性和经济方面来看提纯是很重要的。
为提纯医用蛋白质，使用抗原-抗体反应的免疫亲合色谱法已被采用。但免疫亲合色谱法具有一些缺点它易于失活且昂贵。因而，它的应用局限于提纯方法的最终步骤。
在这些情况下，本发明人为提供更方便且更经济地提纯水蛭素的方法进行了广泛的研究，其结果发现，使用金属离子亲合色谱法，其中以铜离子(Cu++)用作亲合吸附剂(金属离子)并以磷酸盐缓冲剂用作洗脱液，可以实现所述的目的。
因而，本发明的目的之一是提供以低的费用提纯水蛭素的方法。
本发明的另一目的是提供应用金属离子亲合色谱法提纯水蛭素的方法，其中铜离子(Cu++)用作亲合吸附剂(金属离子)，磷酸盐缓冲剂用作洗脱液。
本发明的再一目的是提供从含有水蛭素和其它物质的溶液中提纯水蛭素的方法，该方法包括以下步骤使铜化合物溶液流经装有配位体的柱以使铜离子(Cu++)吸附于所述配位体上；向所述的柱上装填含有水蛭素和其它物质的溶液以使水蛭素与铜离子结合；从铜离子上除去水蛭素并使用磷酸盐缓冲剂作为洗脱液从柱中洗脱水蛭素。
从以下的说明中本领域的普通技术人员可以清楚看出本发明的其它目的、特点和用途。
1975年首次开发了其中以金属离子用作亲合吸附剂的金属离子亲合色谱法用来分离人血清蛋白(Porath等，Nature，258，598(1975))。Porath等人的方法是，依靠氨基酸与金属离子的亲合性，使一些具有咪唑结构的氨基酸结合于金属离子上，所述的金属离子吸附在装填于色谱柱内的配位体上，然后通过使用洗脱液降低所述氨基酸与金属离子间的亲合性从金属离子上脱除氨基酸。所述金属离子的实例可以是如Cu++、Ni++和Zn++的二价金属离子。从工业的角度看金属离子色谱法具有的优点是，用来吸附金属离子的配位体易于制备且其稳定性极好，固定基质(或载体)可以循环。
目前还没有人偿试过应用金属离子亲合色谱法来分离或提纯水蛭素。本发明人首次提出应用金属离子亲合色谱法技术来提纯水蛭素并确定了其最佳操作条件。
按照本发明的使用金属离子亲合色谱法的提纯方法包括的步骤为，使铜化合物溶液流经装有配位体的柱，将铜离子(Cu++)吸附于所述配位体上；在所述的柱上装填要提纯的含有水蛭素的溶液以将水蛭素结合于铜离子上；使用磷酸盐缓冲剂作为洗脱液使水蛭素从铜离子上脱除并从所述柱中洗脱水蛭素。
固定在固定基质或载体上用来吸附作为亲合吸附剂的铜离子的配位体可以是在金属离子亲合色谱法中采用的任何一种。配位体的实例可包括但非限于亚氨基二乙酸(IDA)、三(羧甲基)乙二胺(TED)或次氮基三乙酸(NTA)。优选采用亚氨基二乙酸。
作为固定基质或载体，可采用琼脂糖或右旋糖凝胶，例如琼脂糖凝胶(Sepharose)(Pharmacia)、交联葡聚糖凝胶(Sephadex)(Pharmacia)、Cellufine(Amicon)、Toyopearl(Tosoh)及类似物。
固定配位体的固定基质可以通过本领域普通技术人员公知的技术来制备或者可从市场购得。
本发明采用的金属离子是二价离子，优选铜离子(Cu++)。使铜化合物溶液流经装有配位体的柱可以将铜离子吸附于所述配位体上。铜化合物优选硫酸铜。如锌或镍的任何其它二价金属离子对水蛭素不具有亲合性，因而不能用来提纯水蛭素。
使用缓冲剂可将水蛭素从金属离子上脱除，所述的缓冲剂例如磷酸盐、咪唑浓度梯度洗脱液、PH值梯度洗脱液、或络合剂如乙二胺四乙酸或乙二醇四乙酸。考虑到水蛭素的产率，优选采用磷酸盐缓冲剂，特别是50-500mM磷酸盐、更特别是高达约为100mM的磷酸盐。磷酸盐缓冲液中可含有高达20mM的咪唑，因为当偶和作用很强时，添加咪唑会使得水蛭素从铜离子上的去偶合作用易于进行。
可使用本发明的方法提纯的水蛭素包括由医用水蛭中分离的天然水蛭素、通过培养含有编码水蛭素的重组DNA的酵母或细菌得到的含水蛭素的培养液、市售未提纯的(粗制)水蛭素制品及类似物。通过重组DNA技术可以制得的水蛭素包括HV2水蛭素、LYS47-HV2(它是其中氨基酸47被LYS所取代的HV2水蛭素)、或HV1水蛭素。
可通过本领域技术人员广知的通用培养技术培养载有编码水蛭素的重组DNA的酵母或细菌来生产水蛭素。使用本领域普通技术人员公知的方法从酵母或细菌的培养液中将水蛭素粗分离，例如对培养液进行离心并将所得到的上清液进行超速离心。另外，培养液也可以经过离子色谱法、使用乙醇或丙酮沉淀法进行分离。
对于本发明，在申请中采用的“含有水蛭素的粗溶液”词语意义是含有水蛭素以及其它物质的溶液，它的使用等价于“含有水蛭素和其它物质的溶液”词语。含有水蛭素的粗溶液可包括但非仅限于上述培养液、或由培养液中分离出的粗水蛭素、市售未提纯的水蛭素制品及类似物。
水蛭素通过福林(Folin)方法定量分析，其纯度通过Sohn方法(Sohn等人，J.Microbiol.Biotechnol.，1，266(1991))来确定，在Sohn方法中是使用15-30％梯度乙腈-水在C-8柱(4.6mmX250mm，Phenomenex)上进行高效 液相色谱法(HPLC；Bechman，Model System Gold)。
水蛭素的抗凝血酶滴定度以抗凝血酶单位(ATU)来表示。凝血酶活性标准为NIH-U，1ATU的水蛭素活性定义为完全抑制1NIH-U凝血酶活性的水蛭素的量。
水蛭素的抗凝血酶滴定度可以按照Nadine等人的方法(Nadine等，Biochem.，28，2941(1989))来确定。
也就是说，向50μl凝血酶反应溶液(0.1 M Tris-Cl，PH 8.0，0.12M Nacl，0.01％叠氮化钠，0.1％牛血清清蛋白)中添加0.005、0.01、0.015、0.02、0.025或0.03 ATU真实水蛭素(Accurate Chem.& Scientific)、或本发明实施例中制备的提纯了的水蛭素，然后向其中添加0.03NIH-U/50μl的人凝血酶(Sigma)。随后向其中添加100μl的200μM Chromozym TH(Boehringer Mannheim)，一种凝血酶的合成底物，在37℃下培养所得到的混合物5分钟，使用微量培养板读数器来测量在405nm下，Chromozym TH的颜色显示(Color development)。通过测量在405nm下的每种真实和提纯了的水蛭素，就可计算出实施例中获得的提纯了的水蛭素的滴定值。
以下通过非限定性的实施例对本发明进行更详细的叙述。
实施例1在30℃下，在混合培养基(4％酵母提取液、0.5％酪蛋白氨基酸、1％丁二酸、0.4％氢氧化钠、和4％作为碳源的半乳糖)中培养酵母酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)KCTC 8519P 52小时。培养以间歇添加培养方法来进行，其中间歇添加半乳糖以保持其浓度在2-4％。
培养结束后，将培养液离心得到上清液，并使之经过截止分子量为3,000的YM3超滤膜(Amicon)过滤。如此得到的滤液称为“含有水蛭素的粗溶液”并用于随后提纯方法中。
实施例2从Sigma购得IDA-Sepharose 6B Fast Flow，它是固定有亚氨基二乙酸(IDA)的琼脂糖凝胶。将IDA-Sepharose 6B装填在1.5×30cm的色谱柱中，并使20mM的硫酸铜流经该柱。
实施例3以1ml/分钟的流速使实施例1中制备的1ml含有水蛭素的粗溶液流过实施例2中制备的IDA-Sepharose 6B Fast Flow柱，使水蛭素与铜离子结合，然后用1mM的磷酸盐缓冲剂(PH6.2)洗涤该柱以除去除水蛭素外未结合的蛋白质。之后，用100mM磷酸盐缓冲剂(PH6.2)将水蛭素洗脱。收集含有水蛭素的No.38至54馏份并使之经过截止分子量为3000的膜超滤。在滤液中所含的蛋白质总量和水蛭素的活性分别为1.75mg和4000ATU/mg，而含有水蛭素的起始粗溶液的对应值分别为120.8mg和68.6ATU/mg。水蛭素的产率和纯度分别为85.6％和90％或更高。
比较实施例1-2进行实施例1至3所述的方法，不同之处为以20mM镍离子(比较实施例1)或锌离子(比较实施例2)溶液来取代硫酸铜溶液。
在流经所述柱之前和之后所述溶液中含有的蛋白质总量和水蛭素活性没有改变。
实施例4从Sigma购得目录号为H7016的未提纯的天然水蛭素，按照实施例3的方法对其提纯。
流经所述柱之前蛋白质总量和水蛭素的活性分别为0.08mg和1720ATU/mg，流过该柱后，对应值分别为0.01179mg和10500ATU/mg。水蛭素的产率和纯度分别为90％和97％或更高。
实施例5从CalBioChem购得目录号为377855的未提纯的HV1并按照实施例3的方法提纯。使用含有20mM咪唑的100mM磷酸盐缓冲剂(PH6.2)从铜离子上脱除水蛭素。
在流经所述柱之前蛋白质总量和水蛭素的活性分别为0.93mg和215ATU/mg，而流过该柱后，对应值分别为0.215mg和890ATU/mg。水蛭素的产率和纯度分别为96％和90％或更高。
实施例6从Sigma购得目录号为HO393的重组体水蛭素LYS47-HV2并按实施例3的方法提纯。
在流经所述柱之前蛋白质总量和水蛭素的活性分别为0.01mg和9900ATU/mg，而流经该柱后对应值分别为0.0095mg和12000ATU/mg。水蛭素的产率和纯度分别为90％和99％或更高。
比较实施例3进行实施例1至3所述的方法，不同之处是以含有1M NaCl的乙酸钠缓冲剂(20mM)形成6至4的PH梯度来从所述的柱中洗脱水蛭素。
水蛭素从铜离子上的脱除不完全，水蛭素的产率为约60％。
实施例7进行实施例1至3所述的方法，不同之处是以三羧甲基乙二胺代替亚氨基二乙酸用作配位体。水蛭素的产率和纯度分别为86.3％和90％。
本发明在不偏离其实质和基本特征的条件下还可以按其它方式来实施或体现。因而这里所述的优选实施例只是说明性的而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书指明，权利要求书的意义范围内的各种变形都应为该范围所覆盖。
权利要求
1.一种从含有水蛭素和其它物质的溶液中提纯水蛭素的方法，其特征在于所述方法包括使所述溶液经过金属离子亲合色谱法处理的步骤，其中所述金属离子为铜离子(Cu++)并以磷酸盐缓冲剂用作洗脱液。
2.如权利要求1所述的方法，它包括以下步骤使铜化合物溶液流过装有配位体的柱以将铜离子(Cu++)吸附在所述配位体上；向所述的柱上装填含有水蛭素和其它物质的溶液以使水蛭素结合在铜离子上；使用磷酸盐缓冲剂作为洗脱液使水蛭素从铜离子上脱除并从所述的柱中洗脱水蛭素。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中水蛭素是天然水蛭素、HV1、HV2、或LYS47-HV2。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述铜化合物溶液是硫酸铜溶液。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述磷酸盐缓冲剂的浓度低于100mM。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述磷酸盐缓冲剂含有多达20mM的咪唑。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述配位体为亚氨基二乙酸。
全文摘要
本发明公开了一种从含有水蛭素和其它物质的溶液中提纯水蛭素的方法，其特征在于该方法包括使所述溶液经过金属离子亲合色谱法处理的步骤，其中铜离子(Cu
文档编号C07K1/22GK1127260SQ9511770
公开日1996年7月24日 申请日期1995年9月7日 优先权日1994年9月7日
发明者李尚基, 郑凤铉, 崔毅星, 孙廷熏, 尹悳重, 金明国, 李海敦 申请人:东国制药株式会社, 财团法人, 韩国科学技术研究院