薄壳山核桃品种creek的分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及薄壳山核桃品种creek的分子标记及其应用。


背景技术：

2.薄壳山核桃(carya illinoinensis)，是胡桃科(juglandaceae)山核桃属(carya)的植物，是世界范围重要的干果和木本油料树种。该树种原产于美国南部和墨西哥北部，早期作为绿化树种引进，目前主要转为果用。薄壳山核桃又称碧根果，其坚果含油率高，其中不饱和脂肪酸占总脂肪含量的90％以上，同时含有丰富的酚类物质、矿质元素、氨基酸、维生素等，营养丰富、经济价值高。近年来总种植面积大。随着各地种植薄壳山核桃的热情高涨，对良种苗木的需求迅速增加，良种是确保果园能够优质丰产的基础，如何确保苗木品种的真实性成为亟待解决的问题。
3.薄壳山核桃品种
‘
creek’，单果重7克左右，为雄蕊先熟型品种，由
‘
mohawk
’ב
starking hardy giant’两个品种杂交而成。薄壳山核桃雌雄同株异花，雌雄花期不遇，需对不同品种进行配置才能充分授粉，实现优质丰产。不同品种之间也存在区域适应性和栽培管理的差异。而薄壳山核桃引种和繁育单位较多，过程中存在引种不规范，品种混杂，“一物多名”和“多物一名”等现象。苗期不同品种之间表型差异不明显，难以实现有效区分，如果种植的品种与目标不符，往往需要4到6年开花结实之后才能发现，为育种单位和种植户造成较大的人力、时间和经济上的损失。因此，在薄壳山核桃建园初期，确定品种的真实性就显得尤为重要。在生产实践中，通常依靠有经验的专家通过叶片、果实、花、树姿等表型特征实现品种的辨别，但是不同气候区域条件、不同生长发育阶段、不同栽培条件下表型性状具有较大差异，造成依赖经验的品种鉴别方法成功率不高。近年来，分子标记因能直接检测dna水平的差异，不依赖于表型性状，稳定性强、可重复性好，已广泛应用于动植物的品种鉴定和亲缘关系研究。在薄壳山核桃方面，已有基于分子标记手段的亲缘关系研究，但存在品种覆盖度低、难以区分有血缘关系的品种、操作复杂等问题。
4.因此当前亟需建立一种准确率高、操作简便、鉴别结果稳定的薄壳山核桃品种鉴定方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种简便的分子标记的方法，实现薄壳山核桃品种
‘
creek’品种的鉴定。具体提供一种鉴定薄壳山核桃常用品种
‘
creek’的特异ssr分子标记及其应用。
6.具体地，本发明提供如下技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种薄壳山核桃品种creek的分子标记，所述分子标记能够通过如seq id no.1-2所示的引物对扩增得到。
8.本发明使用生物信息学的方法，从薄壳山核桃全基因组序列中发掘超过14万个
ssr位点，批量设计特异性引物超过6万对。进一步对这些引物进行筛选：1)ssr位点的类型为2～4个碱基重复；2)上下游引物的退火温度相差不超过1℃；3)引物中不包含未知碱基；4)目标产物在100bp～300bp。筛选并合成300对引物。
9.选取在中国应用较多的36个薄壳山核桃品种，其中包含与
‘
creek’有血缘关系的多个品种，包括
‘
mohawk’(
‘
creek’的亲本)、
‘
pawnee’(与
‘
creek’有共同的亲本
‘
mohawk’)、
‘
mahan’(
‘
mohawk’的亲本)，以及
‘
mahan’的子代
‘
choctaw’、
‘
kiowa’、
‘
lakota’等。采集这36个品种的嫩叶，每个品种至少采集3个样品，分别提取基因组dna，对pcr反应条件、扩增产物检测条件进行优化。使用优化后的程序对36个品种进行扩增并检测，筛选一个扩增效果好、稳定性强、在薄壳山核桃常用品种
‘
creek’中有特异性条带的ssr引物，从而实现使用1个ssr标记准确鉴别
‘
creek’的目的。
10.第二方面，本发明提供用于扩增上述分子标记的引物。
11.本发明的引物包括如seq id no.1-2所示的序列。
12.第三方面，本发明提供含有上述引物的试剂或试剂盒。
13.第四方面，本发明提供包含上述引物的dna芯片。
14.第五方面，本发明提供上述分子标记或引物或试剂或试剂盒或dna芯片的以下任一应用：
15.(1)在鉴定薄壳山核桃品种creek中的应用；
16.(2)在薄壳山核桃种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
17.(3)在筛选或创制不同薄壳山核桃品种中的应用；
18.(4)在构建薄壳山核桃品种creek的dna指纹数据库中的应用；
19.(5)在薄壳山核桃品种creek的种苗质量检测中的应用。
20.第六方面，本发明提供鉴定薄壳山核桃品种creek的方法，包括：
21.(1)提取待鉴定薄壳山核桃的dna；
22.(2)以dna为模板，利用seq id no.1-2所示引物进行pcr扩增；
23.(3)根据pcr扩增结果判断待鉴定薄壳山核桃是否为薄壳山核桃品种creek。
24.其中，步骤(3)中判断待鉴定薄壳山核桃是否为薄壳山核桃品种creek的方法如下：
25.当利用seq id no.1-2所示引物进行pcr扩增后，产物在98bp和104bp处均有单一条带时，待鉴定薄壳山核桃为薄壳山核桃品种creek。
26.其中，步骤(2)中pcr反应条件为95℃，2min；94℃变性40s，56℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环；72℃延伸7min；
27.或，95℃，3min；95℃变性2min，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
28.本发明的有益效果在于：
29.采用本发明的单一分子标记就能够有效区分待测品种是否为薄壳山核桃品种
‘
creek’，为薄壳山核桃品种的种植和育种提供保证。
附图说明
30.图1为实施例2中，引物p1和p2对36个品种的pcr扩增产物电泳图。
31.m泳道为dna marker，从下到上的条带大小分别为：100、150、200、250、300、400、500bp；其他1～45泳道每一个泳道为一个样品，第1～45泳道的样品依次为：
‘
kanza’、
‘
mohawk’、
‘
shawnee’、
‘
mahan’、
‘
mahan’(生物学重复)、
‘
osage’、
‘
pawnee’、
‘
mcmillan’、
‘
lakota’、
‘
silver back’、
‘
carter’、
‘
colby’、
‘
stuart’、
‘
greenriver’、
‘
waco’、
‘
major’、
‘
oconee’、
‘
oconee’(生物学重复)、
‘
navaho’、
‘
gloria grande’、
‘
forkert’、
‘
choctaw’、
‘
creek’、
‘
mohawk’(生物学重复)、
‘
elliott’、
‘
barton’、
‘
creek’(生物学重复)、
‘
desirable’、
‘
graking’、
‘
greenriver’(生物学重复)、
‘
hopi’、
‘
jayhawk’、
‘
kiowa’、
‘
lakota’(生物学重复)、
‘
maramec’、
‘
mohawk’(生物学重复)、
‘
nacono’、
‘
navaho’(生物学重复)、
‘
oconee’(生物学重复)、
‘
posey’、
‘
houma’、
‘
yates68’、
‘
shepherd’、
‘
deerstand’、
‘
chetopa’。
32.图2为本发明实施例2中利用引物p1和p2(seq id no.1-2)扩增得到的薄壳山核桃
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
creek’的pcr扩增产物的毛细管电泳图。
具体实施方式
33.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.以下实施例中使用的36个薄壳山核桃品种可通过市售购买途径获得，或者从中国林业科学研究院亚热带林业研究所种质资源库获得，其中，
‘
mahan’、
‘
pawnee’、
‘
greenriver’、
‘
mohawk’、
‘
osage’、
‘
lakota’、
‘
mcmillan’、
‘
carter’、
‘
colby’、
‘
stuart’等品种已在文献(zhang c.c.,yao x.h.,ren h.d.,chang j.,wu j.,shao w.z.,fang q.characterization and development of genomic ssrs in pecan(carya illinoinensis).forests.2020,11(1),61.)中公开。
35.实施例1
36.本实施例提供一种鉴别薄壳山核桃品种
‘
creek’的方法。包括：
37.一、ssr目标片段的扩增
38.1.基因组dna的提取和检测：
39.使用tsingke植物dna提取试剂盒(通用型)，具体步骤如下：
40.(1)将spin column置于collection tube中，加入250μl buffer bl，12000rpm/min离心1min活化硅胶膜；
41.(2)取幼嫩叶片组织(不大于100mg)，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μl buffer gp1，涡旋振荡1min，65℃水浴10～30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
42.(3)加入150μl buffer gp2，涡旋振荡1min，冰浴5min；
43.(4)12000rpm/min离心5min，将上清转移至新的离心管中；
44.(5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入spin column中，12,000rpm/min离心30s，弃废液；
45.(6)向spin column中加入500μl buffer pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；
46.(7)向spin column中加入500μl wash buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；
47.(8)重复操作步骤(7)；
48.(9)将spin column放回collection tube中，12,000rpm/min离心2min，开盖晾干1min；
49.(10)取出spin column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μl te buffer(65℃预热te buffer)，20～25℃放置2min，12,000rpm/min离心2min。
50.(11)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna质量，使用紫外分光光度计检测基因组dna浓度。
51.2.ssr片段的pcr扩增
52.以提取的不同样本基因组dna为模板，使用引物p1：ggtctctcaagatgccttgg(seq id no.1)和p2：aactgatctctggttgcgct(seq id no.2)(根据薄壳山核桃全基因组序列开发的简单重复序列(simple sequence repeat，ssr)标记)对不同样本进行pcr扩增，pcr反应体系见表1。
53.表1
[0054][0055][0056]
pcr反应条件见表2。
[0057]
表2
[0058][0059]
二、ssr目标片段的检测
[0060]
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0061]
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pcr扩增产物，非变性聚丙烯酰胺凝胶配方见表3。
[0062]
表3
[0063][0064]
电泳方法：
[0065]
电泳缓冲液为0.5
×
tbe，左右端空格避免边缘效应，电泳上样量1μl，两端各点一50bp marker。电泳条件为：180v，400ma，电泳180min。
[0066]
2、显影
[0067]
电泳结束后取出胶，用枪尖进行打孔标记，agno3溶液(1.0g agno3溶于1l水中)银染10-15min；
[0068]
显色液(20g naoh溶于1l水中，加入10ml甲醛)显色5-8min；
[0069]
水漂洗2次后置于灯箱上拍照。
[0070]
3、人工判定各个样本的条带大小
[0071]
当p1和p2的扩增产物在98bp和104bp处均有单一条带时，确定该样本为
‘
creek’。
[0072]
实施例2
[0073]
利用本发明的分子标记对36份薄壳山核桃资源材料进行鉴定。pcr扩增产物电泳图见图1。图1中包含了36个品种的样品以及
‘
mahan’、
‘
oconee’、
‘
greenriver’、
‘
navaho’、
‘
creek’、
‘
mohawk’、
‘
lakota’等部分品种的生物学重复，共计45个样品，其它各生物学重复之间均具有相同的检测结果，未全部列出。
[0074]
具体方法为：
[0075]
(1)在薄壳山核桃种质资源圃中采集36个品种的嫩叶，其中包括
‘
creek’有血缘关系的多个品种，包括
‘
mohawk’(
‘
creek’的亲本)、
‘
pawnee’(与
‘
creek’有共同的亲本
‘
mohawk’)、
‘
mahan’(
‘
mohawk’的亲本)，以及
‘
mahan’的子代
‘
choctaw’、
‘
kiowa’、
‘
lakota’等。每个品种设置3个生物学重复。
[0076]
(2)使用试剂盒法(tsingke试剂盒)提取待测样品dna，使用0.8％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，使用核酸测定仪检测dna浓度。使用p1和p2对不同样本进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
[0077]
pcr扩增的反应体系见表4。
[0078]
表4
[0079][0080]
pcr程序为：95℃，3min；95℃变性2min，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
[0081]
(3)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离pcr扩增产物，使用银染检测扩增产物。过程中主要使用的试剂包括：taq酶，dntp，10
×
buffer，30％丙烯酰胺制胶液，5
×
tbe，10％过硫酸铵，四甲基二乙胺，agno3，氢氧化钠和甲醛。
[0082]
(4)对检测结果进行人工判读。
[0083]
36个品种的各生物学重复之间的带型一致，表明在同一品种不同个体间可重复性较好。当该ssr位点的扩增产物在98bp和104bp处各有单一条带时，确定该样本为
‘
creek’。由图1可看出，该ssr位点，能够实现
‘
creek’与其他品种的区分，特别是与它们亲缘关系很近的品种
‘
mohawk’、
‘
pawnee’等也不会对检测结果造成干扰。
[0084]
本实施例进一步对pcr扩增产物进行abi 3730毛细管电泳检测，方法如下：
[0085]
根据琼脂糖凝胶电泳检测结果估计pcr产物浓度，并将产物稀释10倍后，与rox 500内标(大小分别为70,80,100,120,140,160,180,200,240,280,320,360,400,450,490,500base)混匀，反应体系见表5，于95℃反应5min后迅速冰浴3min，然后置于abi3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测，各品种的具体检测结果见表6，其中，
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
creek’品种的pcr扩增产物的检测结果如图2所示。
[0086]
表5
[0087][0088]
表6 36个薄壳山核桃品种pcr扩增产物的条带大小
[0089][0090][0091]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。