1.本发明涉及一种用于替加环素药敏检测的试剂盒及其进行替加环素药敏检测的方法，属于微生物药敏性检测领域。


背景技术：

2.替加环素是一种甘氨酰环素类抗生素，于2005年在美国批准上市，全球共有50多个国家和地区批准和上市了替加环素，2012年初在中国批准上市。目前批注的适应证：(1)复杂性皮肤和皮肤软组织感染；(2)复杂性腹腔内感染；(3)社区获得性细菌性肺炎。由于替加环素具有广谱、抗菌活性强的特点，对于临床常见多重耐药菌感染有非常好的疗效，且临床使用方便，不需根据肾功能受损情况调整剂量，因此该抗菌药物将会在临床抗感染治疗中被广泛使用，此外，替加环素也被认为是治疗多重耐药病原菌的最后一道防线。随着替加环素的上市使用，临床实验室需要广泛开展替加环素的体外药物敏感性(ast)检测，指导临床正确使用。
3.目前，临床实验室检测替加环素ast的方法诸多，然而因替加环素易氧化降解，理化性质不稳定，导致该药的ast存在较多的难点和操作误区，不易标准化。如替加环素ast金标准微量肉汤稀释法操作复杂，耗时较长；梯度扩散法检测的mic值偏高；mts试条只适合科研用；有些商业化系统检测的替加环素药敏结果在验证阶段缺少足够的耐药菌株，且mic偏高，假耐药菌株增加，有的检测系统结果还存在较高的中介相关错误，因此，在临床诊断中迫切需要找到一种方法可以快速、准确的获得替加环素药敏结果。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种用于替加环素药敏检测的试剂盒及其进行替加环素药敏检测的方法。
5.本发明提供的一种用于替加环素药敏检测的试剂盒，该试剂盒包括如下组分：替加环素药敏板、孵育液；
6.所述替加环素药敏板包括药敏板本体，所述药敏板本体的板孔内包被替加环素粉末。
7.本发明，所述药敏板本体为本领域常用的药敏板，具体如96孔板。
8.上述的试剂盒中，所述孵育液为重水。
9.上述的试剂盒中，所述的试剂盒还包括检测基片。
10.上述的试剂盒中，所述的试剂盒还包括培养基；
11.所述培养基选自bbl(美国bd公司)、difco(美国bd公司)、mueller-hinton broth(英国oxoid公司)和iso sensitest肉汤(英国oxoid公司)中的至少一种。
12.所述培养基具体为2
×
bbl培养基(美国bd公司)、2
×
difco(美国bd公司)、2
×
mueller-hinton broth(英国oxoid公司)和2
×
iso sensitest肉汤(英国oxoid公司)中的
至少一种。
13.本发明还提供了一种采用上述的试剂盒进行替加环素药敏试验的方法，包括如下步骤：
14.(1)从待测临床样品平板上挑取单菌落接种于camhb培养基中，35℃
±
2℃孵育，调至为0.5麦氏比浊，制成菌悬液备用；
15.(2)向所述替加环素药敏板中加入所述培养基，使所述替加环素粉末充分溶解，整个操作避光；
16.(3)将待测菌株悬液接种于用于替加环素药敏检测的所述替加环素药敏板中进行孵育，然后向用于替加环素药敏检测的所述替加环素药敏板中加入所述孵育液，继续孵育一段时间，并在不同时间点取样，得到样品，进行拉曼检测；
17.(4)将所述样品拉曼检测得到的图谱数据进行计算，得到经所述继续孵育一段时间后取样样品的代谢抑制水平(英文名称为metabolic inhibition level)≥0.8下的药物浓度中最小抑菌浓度，记为emic-ma；通过所述emic-ma的数值，根据美国食品药品监督局(food and drug administration，fda)和欧洲药敏试验委员会(european committee on antimicrobial susceptibility testing，eucast)制定的结果判断标准，判断所述待测菌株替加环素的药敏性；
18.所述继续孵育一段时间后取样样品的代谢抑制水平，简称mil，其按照下式进行计算得到：
[0019][0020]
cdr
control
为所述样品在不含替加环素培养基中继续孵育一段时间后的c-d ratio；
[0021]
cdr
treated
为所述样品在含不同浓度替加环素培养基中继续孵育一段时间后的c-d ratio；
[0022]
cdr
0h
为所述样品在不含替加环素培养基中孵育0h后的c-d ratio；
[0023]
所述c-d ratio是指所述样品拉曼检测图谱中c-d峰面积/(c-d峰面积+c-h峰面积)，所述c-d峰和c-h峰分别位于2040-2300cm-1
和2800-3050cm-1
。
[0024]
上述的方法中，步骤(2)中，所述替加环素粉末的使用终浓度可为0～128mg/l，具体可为0.0625～32mg/l；
[0025]
所述重水的使用终体积浓度可为20％～100％，具体可为30％、20％～30％、30％～50％、30％～70％、30％～80％或30％～100％。
[0026]
上述的方法中，所述待测菌株包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；
[0027]
上述的方法中，所述待测菌株包括肠杆菌科、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和不动杆菌属中的至少一种。
[0028]
上述的方法步骤(2)中，所述培养的条件可为35℃
±
2℃培养箱中孵育1h，所述继续孵育一段时间的条件可为35℃
±
2℃培养箱中孵育0.5h～1h，具体可为1h。
[0029]
本发明具有以下优点：
[0030]
a)本发明结合了稳定同位素标记的单细胞拉曼光谱检测技术，用于检测替加环素药敏，能快速准确得出替加环素药敏结果；
[0031]
b)本发明的检测试剂盒操作简单、所需时间短、灵敏度高、准确度高。
附图说明
[0032]
图1为鲍曼不动杆菌atcc19606在不同重水浓度孵育2h后拉曼图谱。
[0033]
图2为鲍曼不动杆菌野生型菌株wt在不同浓度替加环素孵育后拉曼图谱。
[0034]
图3为鲍曼不动杆菌非野生型菌株nwt在不同浓度替加环素孵育后拉曼图谱。
[0035]
图4为野生型菌株wt和非野生型菌株nwt在不同浓度替加环素孵育后mil分布图。
[0036]
图5为0.5mg/l替加环素刺激下roc曲线。
具体实施方式
[0037]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]
实施例1、最适重水浓度探究
[0040]
1.实验准备
[0041]
1)培养基制备
[0042]
camhb培养基配制：称取mueller-hinton broth(即m-h肉汤培养基，简称mh培养基)粉末2.1g，溶于100ml ddh2o中，加入ca
2+
溶液和mg
2+
溶液，使其终浓度分别为25mg/l和12.5mg/l，121℃高温高压灭菌15min。
[0043]
2)菌悬液制备
[0044]
将冻存的鲍曼不动杆菌标准株(acinetobacter baumannii，atcc19606)接种至哥伦比亚血平板中，35℃
±
2℃培养箱中过夜培养。挑取单菌落接种至camhb培养基，35℃
±
2℃孵育，调至0.5麦氏比浊。
[0045]
2.重水浓度对菌株cd-ratio的影响
[0046]
将atcc19606菌液加至含不同重水终体积浓度(0％，30％，50％，100％)的camhb培养基中，菌液终浓度为5
×
105cfu/ml，于35℃
±
2℃孵育，2h后取样。每个孵育体系做三个生物学重复。
[0047]
3.待测样品处理
[0048]
将待检测样品用500μl ddh2o清洗，用10μl ddh2o溶解沉淀，取1.5μl稀释液点在检测基片上，自然风干样品。
[0049]
4.拉曼光谱检测
[0050]
100倍物镜下进行拉曼测量，检测参数为：针孔直径125μm，光栅300g/mm，曝光时间2s，激光强度50mw，激光波长532nm，光谱范围400-3500cm-1
。每个样品在不同视野内随机测量60个细菌单细胞的拉曼图谱。
[0051]
5.数据处理与结果分析
[0052]
采集到的拉曼光谱经去背景、基准线归一化和最大值标准化处理后，计算c-d ratio。
[0053]
c-d ratio是指所述样品拉曼检测图谱中c-d峰面积/(c-d峰面积+c-h峰面积)，c-d峰和c-h峰分别位于2040-2300cm-1
和2800-3050cm-1
。
[0054]
使用atcc19606作为模式菌株，探索重水的最适孵育浓度。将atcc19606在添加不
同重水浓度的培养基中孵育，收集拉曼图谱。在添加重水的培养基中会在2040-2300cm-1
区域会出现明显的重水峰，而不添加重水的对照组则没有重水峰。如图1所示，孵育2h后，在重水含量为30％时，atcc19606出现明显重水吸收峰(c-d峰)。选取含30％重水培养基作为后续实验条件。
[0055]
实施例2、替加环素药敏实验
[0056]
1.实验准备
[0057]
1)培养基制备
[0058]1×
camhb培养基：称取mueller-hinton broth粉末2.1g，溶于100ml ddh2o，加入ca
2+
溶液和mg
2+
溶液，使其终浓度分别为25mg/l、12.5mg/l，121℃高温高压灭菌15min；
[0059]2×
camhb培养基：称取mueller-hinton broth粉末4.2g，溶于100ml ddh2o，加入ca
2+
溶液和mg
2+
溶液，使其终浓度分别为50mg/l和25mg/l，121℃高温高压灭菌15min。
[0060]
2)药物配制
[0061]
替加环素(tigecycline，tgc)母液：用ddh2o配制浓度为16mg/ml的替加环素母液，分装至离心管中，用锡纸包好，-80℃保存。(注：整个过程需避光操作并避光保存，避免反复冻融)。
[0062]
3)菌悬液制备
[0063]
将冻存的野生型菌株wt(鲍曼不动杆菌，a.baumannii atcc19606)和非野生型菌株nwt(菌株来源参考文献：曲俊彦，吕晓菊。鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药性及其稳定性研究[j].四川大学学报(医学版)，2017(2).菌株编号：b38
′
)分别接种至哥伦比亚血平板，35℃
±
2℃培养箱中过夜培养。分别挑取单菌落接种于camhb培养基，35℃
±
2℃孵育，调至为0.5麦氏比浊。
[0064]
2.替加环素孵育体系建立
[0065]
将上述相同菌株wt及nwt接种于含有不同浓度tgc溶液并新鲜配制的camhb培养基中，tgc溶液的终浓度分别为0mg/l、0.125mg/l、0.25mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l和8mg/l，35℃
±
2℃培养箱中孵育1h后，分别向上述孵育体系中加入重水，使其终浓度为30％，继续置于35℃
±
2℃培养箱中继续孵育1h，取样进行拉曼检测。每个孵育体系做三个生物学重复。
[0066]
3.待测样品处理
[0067]
将待检测样品用500μl ddh2o清洗，用10μl ddh2o溶解沉淀，取1.5μl稀释液点在检测基片上，自然风干样品。
[0068]
4.拉曼光谱检测
[0069]
100倍物镜下进行拉曼测量，检测参数为：针孔直径125μm，光栅300g/mm，曝光时间2s，激光强度50mw，激光波长532nm，光谱范围400-3500cm-1
。每个样品在不同视野内随机测量60个细菌单细胞的拉曼图谱。
[0070]
5.数据处理与结果分析
[0071]
数据处理时，采集到的拉曼光谱经去背景、基准线归一化和最大值标准化处理后，分析c-d峰面积(拉曼图谱中2040-2300cm-1
区域)和c-h面积(拉曼图谱中2800-3050cm-1
)，计算不同时间下的c-d ratio。
[0072]
基于不同tgc浓度下野生型菌株wt和非野生型菌株nwt重水峰的变化，探究野生型
与非野生型的判断临界值。在0.5mg/l tgc下，野生型菌株wt无c-d峰(2040-2300cm-1
)，如图2所示。相比之下，非野生型菌株nwt在0.5mg/l tgc下仍有明显的c-d峰，如图3所示。对nwt和wt的mil直方图进行了比对，结果显示，除在0.5mg/l tgc下，wt和nwt的mil分布基本一致，如图4所示。此外，在0.5mg/l tgc下，mil取值范围为0-1，当临界值为0.8，能非常准确地进行区分(auc＝0.938)野生型菌株和非野生型菌株，如图5所示。
[0073]
emic-ma为样品在含tgc体系中孵育一段时间后平均mil≥0.8的最小药物剂量。
[0074]
其中mil按照下式进行计算得到：
[0075][0076]
cdr
control
为样品在不含替加环素培养基中继续孵育一段时间后的c-d ratio；
[0077]
cdr
treated
为样品在含不同浓度替加环素培养基中继续孵育一段时间后的c-d ratio；
[0078]
cdr
0h
为样品在不含替加环素培养基中孵育0h后的c-d ratio。
[0079]
这两株鲍曼不动杆菌wt和nwt的emic-ma分别为0.5mg/l和1mg/l，因此，与传统培养法mic结果相同，说明本发明具有准确性。
[0080]
实施例3、替加环素药敏检测试剂盒及应用
[0081]
1.试剂盒组成
[0082]
表1试剂盒的组成
[0083][0084]
2.试剂盒应用
[0085]
1)样品准备：待测临床样品平板上挑取单菌落(如表2中所示的病原菌，菌株来源参考文献zhang z,chen m,yu y,et al.antimicrobial susceptibility among gram-positive and gram-negative blood-borne pathogens collected between 2012-2016as part of the tigecycline evaluation and surveillance trial[j].antimicrobial resistance&infection control,2018,7(1).)接种于camhb培养基，35℃
±
2℃孵育，调至为0.5麦氏比浊，制成菌悬液。
[0086]
2)药敏板准备：向药敏板中加入培养基，使替加环素粉末充分溶解，注意整个过程避光。
[0087]
3)将待测菌悬液接种于药敏板中，35℃
±
2℃培养箱中孵育1h后，分别向药敏板孔中加入重水，使替加环素粉末的使用终浓度为0mg/l、0.125mg/l、0.25mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l、8mg/l、16mg/l和32mg/l，重水终体积浓度为30％，继续置于35℃
±
2℃培养箱中孵育1h，在0h和2h取样。
[0088]
3.待测样品处理
[0089]
将待检测样品用500μl ddh2o清洗，用10μl ddh2o溶解沉淀，取1.5μl稀释液点在检
测基片上，自然风干样品。
[0090]
4.拉曼光谱检测
[0091]
100倍物镜下进行拉曼测量，检测参数为：针孔直径125μm，光栅300g/mm，曝光时间2s，激光强度50mw，激光波长532nm，光谱范围400-3500cm-1
。每个样品在不同视野内随机测量60个细菌单细胞的拉曼图谱。
[0092]
5.数据处理与结果分析
[0093]
数据处理时，采集到的拉曼光谱经去背景、基准线归一化和最大值标准化处理后，分析c-d峰面积(拉曼图谱中2040-2300cm-1
区域)和c-h面积(拉曼图谱中2800-3050cm-1
)，计算不同时间下的c-d ratio及mil，得出emic-ma，通过emic-ma数值，判断其药敏性。
[0094]
6.emic-ma与传统方法评判标准相比
[0095]
表2 emic-ma与传统方法评判标准(fda和eucast)对比结果
[0096][0097]
注：wt为野生型，nwt为非野生型；s为敏感，r为耐药。
[0098]
a.baumannii，鲍曼不动杆菌；e.coli，大肠杆菌；k.pneumoniae，肺炎克雷伯菌；s.aureus，金黄色葡萄球菌。
[0099]
综上，本发明基于emic-ma给出的替加环素药敏试验结果与基于mic结果一致，说明本方法结果可靠、准确。