一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明属于生物活性肽领域，具体涉及一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽及其制备方法和用途。


背景技术：

2.胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质，广泛存在于动物体内的皮肤、骨骼和血管等组织中。其中ⅰ型胶原蛋白占全部胶原蛋白含量的80-90％，主要分布于皮肤、肌腱等组织，也是水产品加工废弃物(皮、骨和鳞)中含量最多的蛋白质。胶原蛋白肽是通过酶解或发酵法水解胶原蛋白得到的产物，分子量较小，在体内更易被吸收利用。
3.皮肤老化主要由生理因素和环境因素而引起。紫外线所引起的老化被称为光老化，是由环境因素所引起的老化中最重要的一种，占面部老化的80％，主要由uva(320-400nm)和uvb(290-320nm)引起。胶原蛋白肽可以提高皮肤弹性、修复胶原纤维、减少皱纹及保湿，因此胶原蛋白肽对皮肤光老化有明显的改善及预防作用。
4.羟脯氨酸(hyp)是胶原蛋白中的特征性氨基酸，这也是导致胶原蛋白肽的活性不同于其他蛋白来源肽的原因之一。由于含hyp胶原小分子肽的生物利用度较高，这类肽在体内可能更易发挥活性作用。关于含hyp胶原小分子肽改善皮肤的作用，目前报道多集中于gly-pro-hyp这条胶原三肽，因此近些年胶原肽的制备工艺也大多集中在富集gly-pro-hyp。shigemura等人报道，胶原二肽hyp-gly能够刺激皮肤成纤维细胞的生长和透明质酸合成(shigemura et al.,food chemistry,2011.129(3):1019-1024)。此外，胶原二肽hyp-gly的吸收效率可能比三肽gly-pro-hyp更高。因此，制备富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽有助于开发更有效的美容类产品。
5.在三螺旋区域含有gly-x-y三肽重复序列是胶原蛋白的典型特征。x和y可以是任何残基，但通常分别是脯氨酸(pro)和羟脯氨酸(hyp)。基于该特点，hyp-gly是胶原序列中出现频次最多的肽序列。因此，胶原蛋白序列中二肽片段hyp-gly的理论含量较高。但目前文献报道的胶原蛋白肽中大多不含有二肽hyp-gly，而其中一篇报道含量最高的仅为0.2％(inoue et al.,journal of the science of food and agriculture,2016.96(12):4077-4081)。这主要是由于轻度水解或不合适的蛋白酶无法有效切断切断-xaa-hyp-gly-中xaa与hyp之间的肽键，同时胶原肽中《1000da小分子肽组分含量也较低，而过度水解则易破坏hyp与gly之间的肽键，因此如何通过控制酶解过程定向制备富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽有待进一步突破。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服目前胶原蛋白肽产品中二肽hyp-gly含量低的问题，提供一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽及其制备方法和用途，采用特定的内切蛋白酶与外肽酶分步水解并控制hyp-gly的定向释放，避免过度酶解对hyp-gly二肽上肽键的破坏，从而提高胶原蛋白肽产品中二肽hyp-gly含量，同时又能提高《1000da小分子肽组分的含量。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽，其中二肽hyp-gly的含量0.8％以上，分子量《1000da的肽占85％以上；
9.优选地，其中二肽hyp-gly的含量0.81-1.07％，分子量《1000da的肽占85-89％。
10.上述富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)将富含胶原蛋白的原料在碱液中浸泡，然后清水洗至ph值为7.0-8.5，加水，进行热处理；冷却至40-50℃后调节反应体系ph值至7.0-8.0；
12.(2)向步骤(1)的反应体系加入内切蛋白酶，40-65℃下酶解2-6h，灭酶，并冷却；
13.所述的内切蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶中的一种以上；
14.所述的内切蛋白酶来源于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌；
15.(3)向步骤(2)的反应体系加入外肽酶，40-60℃下酶解4-8h，灭酶，并冷却；
16.所述的外肽酶为风味蛋白酶和/或氨肽酶a；
17.所述的外肽酶来源于米曲霉或黑曲霉；
18.(4)向步骤(3)的反应体系加入半胱氨酸蛋白酶，40-65℃下酶解2-6h，灭酶，并冷却；
19.所述的内切蛋白酶为木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶；
20.步骤(2)、(3)、(4)所述的内切蛋白酶、外肽酶、半胱氨酸蛋白酶，酶添加量是原料质量0.1％-0.5％，所述内切蛋白酶、外肽酶与半胱氨酸蛋白酶的质量比为(1.0-2.5):(1.25-2.00):1；
21.(5)离心，取上清液，为富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽溶液；
22.所得溶液经过活性炭吸附后，过板框过滤机，经浓缩和喷雾干燥后，得到富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽粉。
23.步骤(1)所述富含胶原蛋白的原料，为牛、猪、羊或鱼等动物的皮、骨、筋、腱、鳞等。
24.步骤(1)所述的碱液，优选浓度0.1-0.6％的naoh溶液；所述的浸泡，优选浸泡1-4h；
25.步骤(1)所述的热处理，优选70-95℃加热1-4h；
26.步骤(2)、(3)、(4)所述的灭酶，是在85-95℃维持15-45min；
27.所述的活性炭吸附，是在50-75℃下吸附30-90min，活性炭的加入量为反应体系中固形物质量的6％-15％；
28.上述方法制得的富含二肽hyp-gly的胶原肽可以用于制备具有美容护肤功效的功能食品。
29.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
30.本发明所制备的胶原小分子肽二肽hyp-gly含量高，可达0.8％以上，且分子量小，《1000da占85％以上，能够显著增加皮肤水分和弹性。
附图说明
31.图1为肽分子量分布图。
具体实施方式
32.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
33.实施例1
34.一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽的制备方法，包括如下步骤：
35.(1)碱洗：将罗非鱼皮浸泡在0.4％的naoh溶液中1.5h。
36.(2)清洗：将经过碱洗的鱼皮用大量清水冲洗，直至其清洗液ph降至7.0-8.5时停止清洗，沥干鱼皮。
37.(3)热提取：按照鱼皮质量加入2倍水，在90℃下热处理2h。热处理后冷却至40℃左右，调节ph至7.5。
38.(4)第一步酶解：往步骤(3)得到的明胶提取液中按鱼皮质量加入0.3％中性蛋白酶，55℃酶解6h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
39.(5)第二步酶解：往步骤(4)得到的酶解液中按鱼皮质量加入0.3％风味蛋白酶，50℃酶解8h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
40.(6)第三步酶解：往步骤(5)得到的酶解液中按鱼皮质量加入0.15％木瓜蛋白酶，55℃酶解4h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
41.(7)活性炭吸附：将酶解液冷却后，离心取清液，按固形物含量加入10％活性炭，在70℃下吸附30min，过板框，取清液。
42.(8)浓缩并干燥：将清液浓缩至固形物40％以上，然后喷雾干燥，得到富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽粉。
43.实施例2
44.一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽的制备方法，包括如下步骤：
45.(1)碱洗：将罗非鱼皮浸泡在0.3％的naoh溶液中2h。
46.(2)清洗：将经过碱洗的鱼皮用大量清水冲洗，直至其清洗液ph降至7.0-8.5时停止清洗，沥干鱼皮。
47.(3)热提取：按照鱼皮质量加入2倍水，在80℃下热处理3h。热处理后冷却至45℃左右，调节ph至7.5。
48.(4)第一步酶解：往步骤(3)得到的明胶提取液中按鱼皮质量加入0.25％碱性蛋白酶，55℃酶解6h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
49.(5)第二步酶解：往步骤(4)得到的酶解液中按鱼皮质量加入0.15％氨肽酶a，50℃酶解8h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
50.(6)第三步酶解：往步骤(5)得到的酶解液中按鱼皮质量加入0.1％木瓜蛋白酶，55℃酶解4h，酶解结束后，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
51.(7)活性炭吸附：将酶解液冷却后，离心取清液，按固形物含量加入12％活性炭，在65℃下吸附45min，过板框，取清液。
52.(8)浓缩并干燥：将清液浓缩至固形物40％以上，然后喷雾干燥，得到富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽粉。
53.实施例3
54.一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽的制备方法，包括如下步骤：
55.(1)碱洗：将罗非鱼皮浸泡在0.5％的naoh溶液中1h。
56.(2)清洗：将经过碱洗的鱼皮用大量清水冲洗，直至其清洗液ph降至7.0-8.5时停止清洗，沥干鱼皮。
57.(3)热提取：按照鱼皮质量加入2倍水，在90℃下热处理2h。热处理后冷却至50℃左右，调节ph至7.0。
58.(4)第一步酶解：往步骤(3)得到的明胶提取液中按鱼皮质量加入0.2％复合蛋白酶，50℃酶解4h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
59.(5)第二步酶解：往步骤(4)得到的酶解液中按鱼皮质量加入0.25％氨肽酶a，50℃酶解6h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
60.(6)第三步酶解：往步骤(5)得到的酶解液中按鱼皮质量加入0.2％菠萝蛋白酶，45℃酶解4h，酶解结束后，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
61.(7)活性炭吸附：将酶解液冷却后，离心取清液，按固形物含量加入12％活性炭，在60℃下吸附60min，过板框，取清液。
62.(8)浓缩并干燥：将清液浓缩至固形物40％以上，然后喷雾干燥，得到富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽粉。
63.对比例1
64.一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽的制备方法的制备方法，包括如下步骤：
65.(1)碱洗：将罗非鱼皮浸泡在0.4％的naoh溶液中1.5h。
66.(2)清洗：将经过碱洗的鱼皮用大量清水冲洗，直至其清洗液ph降至7.0-8.5时停止清洗，沥干鱼皮。
67.(3)热提取：按照鱼皮质量加入2倍水，在90℃下热处理2h。热处理后冷却至50℃左右，调节ph至7.0
68.(4)第一步酶解：往步骤(3)得到的明胶提取液中按鱼皮质量加入0.3％中性蛋白酶，55℃酶解6h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
69.(5)第二步酶解：往步骤(4)得到的酶解液中按鱼皮质量加入0.15％木瓜蛋白酶，55℃酶解4h，酶解结束后，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
70.(6)活性炭吸附：将酶解液冷却后，离心取清液，按固形物含量的12％加入活性炭，在60℃下吸附60min，过板框，取清液。
71.(7)浓缩并干燥：将清液浓缩至固形物40％以上，然后喷雾干燥，得到富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽粉。
72.对比例2
73.一种富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽的制备方法，包括如下步骤：
74.(1)碱洗：将罗非鱼皮浸泡在0.3％的naoh溶液中2h。
75.(2)清洗：将经过碱洗的鱼皮用大量清水冲洗，直至其清洗液ph降至7.0-8.5时停止清洗，沥干鱼皮。
76.(3)热提取：按照鱼皮质量加入2倍水，在90℃下热处理2h。热处理后冷却至50℃左右，调节ph至7.0
77.(4)第一步酶解：往步骤(3)得到的明胶提取液中按鱼皮质量加入0.2％复合蛋白酶，50℃酶解4h，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
78.(5)第二步酶解：往步骤(4)得到的酶解液中按鱼皮质量加入0.25％氨肽酶a，50℃酶解6h后，料液升温至95℃维持30min进行灭酶，冷却。
79.(6)活性炭吸附：将酶解液冷却后，离心取清液，按固形物含量加入12％活性炭，在60℃下吸附60min，过板框，取清液。
80.(7)浓缩并干燥：将清液浓缩至固形物40％以上，然后喷雾干燥，得到富含二肽hyp-gly的胶原小分子肽粉。
81.参考文献(ichikawa et al.,international journal of food sciences and nutrition,61(1),52-60)，采用液质联用的方法测定不同实施例、对比例所得胶原肽中的二肽hyp-gly含量，对比结果如表1所示。
82.明显发现实施例1、2、3的二肽hyp-gly含量均可达0.8％以上，显著优于未采用第三步半胱氨酸蛋白酶水解的对比例2，而未采用第二步外肽酶水解的对比例1则未检测到二肽hyp-gly。
83.表1胶原蛋白肽中二肽hyp-gly的含量
[0084][0085]
注：nd表示未检出
[0086]
参考《gb31645-2018胶原蛋白肽》中的方法，测定各实施例、对比例所得胶原小分子肽的肽分子量分布，结果如图1所示，可以看出实施例1、2和3胶原小分子肽中，《1000da分别占88％、86％和89％小分子肽含量显著高于未采用第二步外肽酶水解对比例1(61％)和未采用第三步半胱氨酸蛋白酶水解的对比例2(77％)。
[0087]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。