1.本发明涉及病毒学领域,具体涉及双皮质肾上腺素样激酶1的新用途，该用途具体为在制备j亚群禽白血病病毒复制增强剂中的应用。


背景技术：

2.j亚群禽白血病病毒(alv-j)于1988年在英国首次从肉鸡中分离得到，属于反转录病毒科甲型反转录病毒属，主要引起包括髓细胞瘤、血管瘤、成红细胞瘤、肉瘤和肾瘤等肿瘤，死亡率通常为1％-5％，高峰期可达到50％，给我国的养禽业带来严重的经济损失，目前主要通过净化进行防控，至今仍未有疫苗研制成功。
3.随着对alv-j研究的不断深入，需要不断扩大alv-j培养量，而该病毒具有典型的慢病毒特性，复制周期较长；且在alv-j自然感染的状态下，其产生的病毒载量较低，难以获得足够的病毒用于后续研究，极大的限制了alv-j研究进展。
4.由于在一定体积的静置培养物中，多达90％的逆转录病毒受限于与靶细胞接触面积而不能感染，因此目前相关提高病毒载量的产品大多是以病毒接触增强剂的形式存在，原理是通过物理作用将病毒大量富集在细胞表面，增加病毒与细胞的接触，最大限度促进病毒感染细胞，但是由于不参与病毒和细胞的生理过程，所以无法保证对病毒复制的促进作用。
5.因而能否获得一种alv-j全新的病毒复制增强剂提高alv-j产量，解决目前在生产和实践中遇到的病毒产量低的问题成为本领域技术人员急需要解决的问题之一。


技术实现要素：

6.本发明的发明人针对现有技术存在的空白之处，提供了双皮质肾上腺素样激酶1(dclk1)的新用途，该用途为制备j亚群禽白血病病毒复制增强剂，发明人发现dclk1能够与alv-j su蛋白互作并促进细胞周期从g1期向s期转化进而显著提高alv-j复制量，在此基础上，发明人进一步构建了dclk1过表达质粒pcdna3.1-dclk1转染df-1细胞，使dclk1在细胞中高表达进而显著促进alv-j复制，提高病毒产量，并且对细胞无毒副作用，证明dclk1可作为病毒复制增强剂应用于alv-j的培养。
7.发明人经过研究后发现，alv-j属于反转录病毒，在复制过程中要经历包括吸附、穿入与脱壳、生物合成、组装和释放等过程。alv-j su蛋白与其受体的结合开启了复制的第一步。su蛋白与受体结合后，引起tm蛋白的构象变化，导致病毒与细胞发生膜融合，然后带核衣壳的病毒核芯进入细胞内，在酶的帮助下开始生物合成。本发明发明人首次发现alv-j su蛋白可以与dclk1相互作用促进其复制。
8.除此之外，细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为细胞间期与细胞分裂期两个阶段，而间期又分为dna合成前期(g1期)、dna合成期(s期)与dna合成后期(g2期)三期，发明人进一步研究后发现dclk1可以促进细胞从g1期向s期的过渡，从而促进alv-j复制。
9.在上述两项理论基础上，发明人发现了双皮质肾上腺素样激酶1(dclk1)的新用途，该用途为制备j亚群禽白血病病毒复制增强剂，该用途填补了本领域的空白。
10.本发明的具体技术方案如下：
11.alv-j属于反转录病毒，电镜超薄切片显示，其病毒粒子最外层是起源于宿主细胞膜的类脂质囊膜糖蛋白，表面有特征性的放射状纤突。病毒env基因编码的糖基化蛋白构成病毒的囊膜蛋白，包含gp37基因编码的跨膜糖蛋白亚单位(tm)和gp85基因编码的膜表面糖蛋白亚单位(su)两个部分。su含有病毒的受体决定簇，从而能决定病毒的宿主范围和特异性。alv-j在复制过程中要经历包括吸附、穿入与脱壳、生物合成、组装和释放等反转录过程。alv-j su蛋白与其受体的结合则开启了复制的第一步。dclk1可以与alv-j su蛋白直接互作，促进细胞周期从g1期向s期转化进而促进alv-j的病毒复制。
12.基于发明人的尝试，通过蛋白质组学检测(tandem mass tag,tmt法)首次筛选出在alv-j组高表达的差异蛋白双肾上腺素样激酶-1(dclk1)并检测，证明dclk1通过与su蛋白互作发挥功能，促进细胞周期从g1期向s期过渡进而促进alv-j的病毒复制，提高alv-j产量，并且细胞毒性很小。因此，发明人发现了dclk1的新用途，并决定将dclk1作为alv-j复制增强剂，提高alv-j产量。具体技术方案如下：
13.双皮质肾上腺素样激酶1编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
14.本发明基于蛋白组学dclk1在alv-j中显著上调的结果，设计合成dclk1 qpcr引物如下：
15.f：cccagggagtgagaacaa；
16.r：tacctcctttagcagtagca；经过验证结果与组学数据相符；
17.dclk1在感染alv-j nx0101毒株的df-1中高表达；继而构建了dclk1的过表达质粒pcdna3.1-dclk1和对照质粒pcdna3.1-nc，干扰质粒shdclk1-1、shdclk1-2和对照质粒sh-nc，分别转染至感染alv-j nx0101毒株的df-1并检测，在基因转录和蛋白表达水平证明dclk1被alv-j激活并促进病毒复制；
18.通过激光共聚焦实验证明，fitc标记的gp85蛋白与cy3标记的dclk1在共聚焦显微镜下观察到绿色荧光和红色荧光发生重叠，初步证明dclk1与alv-j蛋白可发生互作；
19.通过免疫共沉淀证明dclk1与alv-j su蛋白可以直接互作；
20.通过流式细胞术证明过表达dclk1可以促进细胞周期从g1期向s期转化进而促进alv-j的病毒复制，干扰则反之；
21.综上说明dclk1可以作为alv-j复制增强剂，提高alv-j产量。
22.上述过程的更为具体的步骤如下：
23.1、感染alv-j的蛋白质组学中dclk1蛋白表达量显著上调(fold change》1.3)；
24.alv-j激活dclk1的表达：
25.对正常df-1细胞和感染alv-j病毒的df-1细胞用tmt法(tandem mass tag)进行蛋白质组学检测，每组3个平行，对正常组和alv-j感染组蛋白质组学数据中的95个差异蛋白进行生物信息学分析并查阅相关文献，筛选出了与alv-j病毒复制密切相关的关键上调差异蛋白“dclk1”，并对dclk1进行荧光定量pcr引物设计及抗体的购买；df-1密度80％左右时接种alv-j(tcid
50 10-4
)，分别收集alv-j接种后24h、48h和72h的细胞提取细胞rna和总蛋
白，并借助qpcr和western blot检测dclki和alv-j的转录水平和蛋白水平。结果显示：感染alv-j后，dclk1上调；证明alv-j可以激活dclk1的表达。
26.2、dclk1与alv-j su蛋白发生相互作用：
27.alv-j感染df-1，用含有1％fbs的dmem维持72h，进行激光共聚焦实验，fitc标记gp85蛋白，cy3标记dclk1，在共聚焦显微镜下观察到绿色荧光和红色荧光发生重叠，证明dclk1与alv-j囊膜蛋白su共定位于胞质中；免疫共沉淀使用alv-j su蛋白单克隆抗体为诱饵，沉淀dclk1，对沉淀的蛋白样品进行western blot检测，证明dclk1与alv-j su蛋白可以直接互作。
28.3、过表达dclk1促进alv-j复制；
29.选用pcdna3.1真核表达质粒构建真核表达载体，将测序完整无突变的dclk1碱基序列连入pcdna3.1真核表达载体，将构建好的质粒转化进dh5α感受态细胞中，转化完成后摇菌并提取质粒，送华大基因测序，测序无误后进行细胞转染；
30.在df-1转染dclk1过表达质粒12h后，接种alv-j，维持72h后通过qpcr和western blot检测病毒载量，结果显示：与转染pcdna3.1空载体组相比，转染过表达dclk1质粒的细胞中，alv-j的病毒载量显著上调(3倍以上)。
31.4、干扰dclk1显著抑制了alv-j的复制：
32.使用干扰质粒shrna对dclk1促进alv-j复制进行反向验证。通过吉玛公司构建两条dclk1干扰质粒分别为shdclk1-1、shdclk1-2，其核苷酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示。将干扰质粒转染细胞接种alv-j，结果发现：干扰dclk1后，alv-j的病毒载量与转染空载组相比显著下调。
33.5、dclk1促进细胞周期从g1期向s期转化：
34.将dclk1过表达质粒和干扰质粒转染到df-1细胞中，24h后感染alv-j，收集细胞用溴化乙锭(pi)染色后，通过流式细胞术检测各组细胞周期的变化，结果显示：与转染pcdna3.1空载体组相比，转染过表达dclk1质粒的细胞中，细胞周期由g1向s期转变，延长了s期持续时间(1.53倍)，而敲低dclk1则产生相反的效果。
35.基于上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点为：
36.1.发明人发现了禽反转录病毒alv-j感染细胞后可激活dclk1的表达，该蛋白可作为禽反转录病毒alv-j复制增强剂，收取病毒时与对照组相比，病毒载量增加了3倍以上。
37.2.建立了dclk1重组质粒促进alv-j复制的新方法，该方法使dclk1在细胞中可以持续表达，高效促进病毒复制。
38.3.明确了dclk1促进alv-j复制的机理：dclk1通过调控病毒宿主细胞的周期由g1期向s期转变，并延长s期时间，从而促进alv-j的复制。
附图说明
39.图1为实施例1中通过蛋白质组学方法筛选与alv-j病毒复制密切相关的显著差异蛋白dclk1分析得到的差异蛋白火山图(横坐标表示差异蛋白的差异倍数，纵坐标表示p值)；
40.图2为差异蛋白聚类热图，其中1-3为正常组的3个平行，4-6为alv-j感染组的3个平行(纵向表示样品的聚类，横向表示蛋白的聚类，聚类枝越短表示相似性越高)；
41.图3为go富集分析图；
42.图4为alv-j病毒感染df-1细胞后激活dclk1表达的相关示意图，
43.图中a为实施例2中提取alv-j感染df-1和正常df-1的细胞rna，通过qpcr检测alv-j病毒拷贝数柱状图；b为感染alv-j后，提取细胞rna，检测dclk1的mrna在0-72h动态表达示意图；c为实施例2中通过western blot检测alv-j感染细胞和正常细胞中dclk1与alv-j gp 85蛋白表达量灰度图；
44.图5为dclk1和alv-j的su蛋白互作示意图，
45.图中a为实施例3中dclk1使用抗dclk1兔多克隆抗体和cy3标记二抗；alv-j su蛋白使用alv-j su蛋白单克隆抗体和fitc标记二抗；merge表示alv-j感染组中dapi、anti dclk1和anti alv-j的重叠示意图；b为实施例3中alv-j感染72h的df-1细胞裂解产物使抗alv-j su抗体沉淀dclk1,通过western blot检测洗脱产物中含有dclk1和alv-j su示意图；
46.图6为dclk1有效增加alv-j载量相关示意图，
47.图中a、b和c为实施例4中df-1转染pcdna3.1-dclk1或对照质粒(pcdna3.1)后接种alv-j，维持72h后提取细胞rna，通过qpcr和western blot分别检测dclk1、alv-jmrna水平柱状图和蛋白水平灰度图；d、e和f为实施例4中shrna转染df-1(shdclk1-1，shdclk1-2或shnc)后，alv-j感染细胞并提取细胞rna，通过qpcr和western blot分别检测dclk1、alv-j mrna水平柱状图和蛋白水平灰度图；
48.图7为过表达dclk1促进alv-j感染的细胞周期从g1期向s期分化示意图，
49.图中a为实施例5中pcdna3.1-dclk1和对照质粒pcdna3.1-nc转染df-1细胞后，alv-j感染细胞并收集细胞样品进行流式检测示意图；b为a图中对流式检测不同细胞周期占比分析柱状图；c为实施例5中shrna转染df-1(shdclk1-1，shdclk1-2和shnc)后，alv-j感染细胞并收集细胞样品进行流式检测示意图；d为c图中对流式检测不同细胞周期占比分析柱状图。
具体实施方式
50.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法或直接交由基因公司完成；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
51.实施例1对感染alv-j的df-1细胞进行tmt定量蛋白质组学筛选及分析
52.1、细胞样品的准备
53.df-1细胞培养在25cm2细胞培养瓶中，将细胞分为2个组别，每组3个重复：
54.组别1，df-1细胞融合度达到70％时，加入1ml alv-j毒液后维持2h，弃掉细胞瓶内毒液，加入含有1％fbs的dmem培养基，在37℃5％co2培养箱中维持72h(前期实验表明，alv-j感染df-1细胞72h能够达到alv-j载量的峰值)；
55.组别2，df-1细胞融合度达到70％时，加入含有1％fbs的dmem，在37℃的5％co2培养箱内培养维持72h。
56.2、蛋白提取
57.细胞用胰酶消化后，分别加入4倍体积裂解缓冲液，超声裂解。4℃，12000g离心10min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。
58.3、胰酶酶解
59.蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mm，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mm，室温避光孵育15min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2m。以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h。
60.4、tmt标记
61.胰酶酶解的肽段用strata x c18(phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5m teab溶解肽段，根据tmt试剂盒操作说明标记肽段。操作简单描述如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。
62.5、hplc分级
63.肽段用高ph反向hplc分级，色谱柱为agilent 300extend c18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、ph 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为18个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。
64.6、液相色谱-质谱联用分析
65.肽段用液相色谱流动相a相溶解后使用easy-nlc 1000超高效液相系统进行分离。流动相a为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相b为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。
66.液相梯度设置：0-26min，7％-25％b；26-34min，25％-38％b；34-37min，38％-80％b；37-40min，80％b，流速维持在350nl/min。
67.肽段经由超高效液相系统分离后被注入nsi离子源中进行电离然后进orbitrap fusiontm质谱进行分析。离子源电压设置为2.0kv，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的orbitrap进行检测和分析。
68.一级质谱扫描范围设置为350-1550m/z，扫描分辨率设置为60,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，orbitrap扫描分辨率设置为30,000。
69.数据采集模式使用数据依赖型扫描(dda)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前10肽段母离子依次进入hcd碰撞池使用35％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，设置自动增益控制(agc)为5e4，信号阈值设置为5000ions/s，最大注入时间设置为100ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒避免母离子的重复扫描。
70.7、数据库搜索
71.二级质谱数据使用maxquant进行检索。检索参数设置：数据库为uniprot gallus(29480条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(fdr)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为trypsin/p；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；first search和main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白n端的乙酰化。定量方法设置为tmt-10plex，蛋白鉴定、psm鉴定的fdr都设置为1％。
72.8、蛋白质组学分析
73.go功能注释与显著性富集分析：蛋白的go注释被分为3个大类：生物进程、细胞组成、分子功能。费歇尔精确双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。go富集检验p-value值小于0.05被认为是显著的。
74.聚类分析：首先收集所用蛋白分组富集到的功能分类信息和对应的富集p-value值(基于1.3倍差异蛋白)，然后筛选出至少在一个蛋白分组中为显著富集(p-value《0.05)的功能分类。筛选得到的p-value数据矩阵首先经过以-log
10
的对数变换，然后将变换后的数据矩阵对各功能分类运用z变换。最后将z变换后得到的数据集使用分层聚类(欧式距离，平均连接聚类)方法做单边聚类分析。聚类关系使用heatmap绘制出热图进行可视化展示。
75.结果如下：通过上述分析，本发明人共鉴定出95种差异显著的蛋白质，结果如图1为差异蛋白火山图，包括48种显着上调的蛋白质和47种显着下调的蛋白质。横坐标表示差异蛋白的差异倍数，纵坐标表示p值；图2为差异蛋白聚类热图，发明人在感染alv-j的上调差异蛋白中发现了在家禽领域未报道过的一个蛋白“dclk1”，图3为go功能分析显示dclk1参与单细胞生物进程。
76.通过对蛋白质组学进行生物信息学分析，发现dclk1的高表达很可能与alv-j复制存在密切的联系。该dclk1为双皮质肾上腺素样激酶1，其编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
77.实施例2 alv-j感染df-1细胞后激活dclk1的表达
78.为了研究alv-j感染对dclk1表达的影响，本实施例构建了alv-j感染的df-1细胞模型，分别通过qpcr和western blot检测alv-j和dclk1在24、48和72h的表达情况。
79.1、荧光定量引物的设计
80.根据genbank登录号nm_001257257公开的dclk1序列，获得dclk1蛋白cds序列(272-2461)，设计引物，由华大基因合成并验证，引物序列如下：
81.f-cccagggagtgagaacaa-，seq id no.5所示；
82.r-tacctcctttagcagtagca-，seq id no.6所示；
83.2、细胞材料的制备
84.按照规定细胞密度密度将df-1细胞接种到12孔细胞培养板上，设置normal、alv-j两个组，混匀后于37c 5％co2培养箱中培养过夜；待细胞密度达到80％左右时将alv-j nx0101病毒接种至细胞培养板上，培养箱孵育1.5h，弃掉病毒液，改为1％dmem培养，分别收集24dpi、48dpi、72dpi细胞样品，冻存至-80c冰箱。
85.3、细胞rna提取
86.1)轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入350μl裂解buffer rl(使用前请加入β-巯基乙醇)，用移液枪反复吹打直至裂解液中无明显沉淀。
87.2)将所有溶液转移至安放在收集管中的过滤柱cs上，12000rpm，离心2min，收集滤液。
88.3)向滤液中加入等体积的70％乙醇，使用移液枪混合均匀。将混合液全部转入吸附柱cr3中(已安放在收集管中)，12000rpm,离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
89.4)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm,离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
90.5)dnaseⅰ工作液的配制：取10μl dnaseⅰ储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μl rdd溶液，轻柔混匀。
91.6)向吸附柱cr3中央加入80μl dnaseⅰ工作液，室温放置15min。
92.7)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm,离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
93.8)向吸附柱cr3中加入500μl去漂洗液rw(使用前请加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm,离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
94.9)重复步骤8)。
95.10)12000rpm，离心2min，倒掉废液。将吸附柱cr3置于室温放置数分钟，将吸附材料中残余的漂洗液彻底晾干；
96.11)将吸附柱cr3转入一个新的rnase-free离心管中，加入30-10μl rnase-free dd h2o室温放置5min，1200rpm，离心2min，得到rna溶液。
97.4、rna逆转录为cdna：
98.反转录pcr操作步骤：测定rna浓度和纯度，参照primescript rt master mix说明书，进行反转录pcr，37℃1min，85℃5s。2μl反应体系：
[0099][0100]
5、real-time pcr
[0101]
采用real-time pcr sybr green荧光定量pcr试剂盒，按照引物序列，扩增基因，每个循环结束后采集荧光信号，同时用real-time pcr仪检测gapdh基因的拷贝数，用来校正目的基因的检测结果。反应体系为20μl，加样在冰上操作，real-time pcr反应过程为：95℃30s；95℃5s、60℃35s、34个循环；95℃15s；60℃1min；95℃15s。每个样品设定三个重复，荧光反应结束后，分析溶解曲线，判定pcr反应的特异性，记录每组样品的ct值。利用2
‑△△
ct
法进行alv-j gag基因和dclk1基因表达量的相对定量分析，采用spss 17.0统计学软件进行单因素分析，p《0.05为有显著性差异，p《0.01为有极显著性差异，表明结果具有统计学意义。
[0102]
图4a能够说明alv-j感染的df-1细胞模型构建成功；图4b能够说明在alv-j感染的细胞中，dclk1胞内mrna表达水平显着高于未感染的细胞，即alv-j能够激活dclk1的表达。
[0103]
6、蛋白浓度检测
[0104]
bca蛋白定量试剂盒检测蛋白的浓度，步骤如下：
[0105]
1)标准品稀释：用灭菌pbs或dd h2o对bsa标准品进行稀释：
[0106]
2)bca工作液配制：按照样品的数量，将试剂a与试剂b按体积比50:1的比例配制适量bca工作液，并充分混匀；
[0107]
3)每个标准品管和样品管内加入200l混匀的bca工作液；
[0108]
4)再吸取10μl的稀释好的标准品和变性后的待检测样品加入对应管内，充分混
匀；
[0109]
5)置于37℃恒温箱孵育30min后冷却至室温或室温放置2h；
[0110]
6)用紫外分光光度计的562nm波长，检测溶液的吸光值；
[0111]
7)以标准液的吸光值为横坐标，浓度值为纵坐标绘制标准曲线；
[0112]
8)根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
[0113]
7、western blot实验
[0114]
为验证蛋白表达水平，我们选择了病毒和蛋白对应的标志性蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体进行western blotting检测，具体步骤如下：
[0115]
1)煮样：取等量(蛋白含量30μg)的悬浮液样品，加入5
×
sds蛋白质上样缓冲液，100℃金属浴变性5min；
[0116]
2)配制sds-page凝胶：10％的分离胶、5％的浓缩胶，待胶自然凝固后，将其放入电泳装置中，电泳槽中加入足量的1
×
tris-甘氨酸电泳缓冲液；
[0117]
3)加样：每孔加样量15μl。蛋白marker上样量10μl/孔。
[0118]
4)电泳：先使用80v电压使样品在浓缩胶中浓缩，待染料前缘进入分离胶后(一般30min左右)，将电压升至120v，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部且开始泳出凝胶底面，终止电泳。
[0119]
5)取胶：小心撬开玻璃板，割去浓缩胶以及多于的分离胶部分，将凝胶置于电转缓冲液中湿润；
[0120]
6)剪膜：剪一张与凝胶大小相同的pvdf膜(厚度0.22μm)，甲醇中浸泡约30s-2min，然后再浸泡于电转缓冲液中；
[0121]
7)转膜：安装转印装置，三明治法：即负极夹-海绵垫-三层滤纸-凝胶-pvdf膜-三层滤纸-海绵垫-正极夹，安装过程中保证凝胶与pvdf膜间没有气泡，若产生气泡，用玻璃棒轻轻赶出。将转印装置放入转移电泳仪中，加入膜转移缓冲液，240ma恒流电泳2h左右，蛋白质将被转移到pvdf膜上，转印结束；
[0122]
8)封闭：取下pvdf膜，可剪掉一个小角，标记正反，5％脱脂乳室温摇床封闭1.5h或4℃过夜，tbst缓冲液漂洗5次，每次5min；
[0123]
9)一抗孵育：一抗4℃过夜或室温摇床孵育1.5h，tbst缓冲液洗涤3-5次，每次5min；
[0124]
10)二抗孵育：二抗(tbst缓冲液稀释抗体比例：hrp标记的山羊抗兔1:1000，hrp标记的山羊抗小鼠1:1000)室温摇床孵育1h，tbst缓冲液洗涤3-5次，每次5min；
[0125]
11)显影：pvdf膜置于暗室中ecl显影。此过程参照beyoecl plus(超敏ecl化学发光试剂盒)进行。
[0126]
图4c能够说明在alv-j感染的细胞中，dclk1蛋白表达水平显著高于正常组。
[0127]
结果如下：本实施例用alv-j感染df-1细胞，并通过qpcr和western blot检测alv-j和dclk1的动态表达。结果显示在alv-j感染后，dclk1的mrna和蛋白水平表达量从24hpi到72hpi持续增加(p《0.01)(图4a、4b和4c)。这些结果表明alv-j能够激活dclk1的表达。
[0128]
实施例3 dclk1与alv-j的su蛋白相互作用
[0129]
为了阐明alv-j是否通过su和dclk1相互作用招募dclk1，本实施例进行了激光共聚焦试验和免疫共沉淀分析：
[0130]
1、激光共聚焦对dclk1和alv-j的su蛋白表达定位检测
[0131]
1)细胞预处理：细胞培养于激光共聚焦平皿中，将培养的细胞分为两组，第一组，当细胞达到70％融合度时感染alv-j，用含1％胎牛血清的dmem培养基维持72h；第二组，当细胞达到70％融合度时换用含1％胎牛血清的dmem培养基维持72h；
[0132]
2)洗涤：弃掉平皿内的培养基，加入1ml预热的pbs洗涤3次，洗涤残留的培养基和死细胞；
[0133]
3)固定细胞：向平皿中加入1ml预冷的乙醇和丙酮混合液(2:3)，维持7min；
[0134]
4)洗涤：加入2ml pbs洗涤三次，每次5min；
[0135]
5)封闭：加入1.5ml 5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h；
[0136]
6)洗涤：步骤同(4)；
[0137]
7)孵育一抗：分别孵育dclk1和alv-j抗体，37℃孵育1h；
[0138]
8)洗涤：步骤同(4)；
[0139]
9)孵育二抗：孵育二抗，dclk1加入cy3，alv-j孵育fitc；
[0140]
10)洗涤：步骤同(4)；
[0141]
11)细胞核染色：使用细胞核特异性染料dapi标记细胞核，37℃孵育5min；
[0142]
12)洗涤：步骤同(4)；
[0143]
13)激光共聚焦显微镜观察。
[0144]
图5a中激光共聚焦结果显示：dclk1和alv-j都在细胞浆中表达，两者荧光可以重叠在一起，说明两者存在互作关系。
[0145]
2、免疫共沉淀检测dclk1和alv-j的su蛋白互作
[0146]
1)制备样品：df-1汇合度达到70％时接种alv-j，维持2h，换用含有1％的dmem培养基继续维持72h；弃掉培养基，使用pbs洗涤3次，每1
×
106加入200μl试剂盒中自带的裂解/平衡缓冲液，冰上裂解20min，随后在4℃环境中12000rpm离心10min，上清即为细胞蛋白样品，将样品分两份，第一份用于检测样品中是否含有要检测的目标蛋白，第二份用于接下来的免疫沉淀试验；
[0147]
2)孵育诱饵抗体：alv-j单克隆抗体1d4加入裂解的蛋白样品中，在4℃孵育1h；
[0148]
3)免疫沉淀：首先，将100μl裂解/平衡缓冲液加入吸附柱中，室温3000rpm离心1min。丢弃流穿物并，然后将色谱柱放入新的收集管；加入孵育过alv-j抗体的细胞蛋白样品，室温3000rpm离心1min，并将吸附柱转移到一个新的离心管中；向吸附柱中加入100μl洗涤缓冲液，3000rpm离心1min，并将吸附柱转移到一个新的离心管中；加入3-5μl中和缓冲液到吸附柱中，然后加入35μl洗脱缓冲液，以3000rpm离心1次即可；
[0149]
4)western blot分析样品：将第一组样品和经过处理的第二组样品进行sds-page和western blot分别检测样品中是否含有dclk1和alv-j su蛋白。
[0150]
图5b中以alv-j单克隆抗体1d4为诱饵能够沉淀下dclk1，进一步说明dclk1可以和alv-j su蛋白发生互作。
[0151]
结果如下：本实施例通过激光共聚焦试验和免疫共沉淀分析证明了alv-j通过su和dclk1相互作用招募dclk1，促使其发挥作用。
[0152]
实施例4 dclk1过表达、干扰载体的构建及对alv-j复制的影响
[0153]
为了评估dclk1在alv-j复制中的生物学重要性，本实施例构建了dclk1过表达质
粒和干扰质粒，以验证dclk1对alv-j载量的促进作用。
[0154]
1、dclk1碱基序列的优化和dclk1过表达载体的构建
[0155]
dclk1 cds区密码子优化和全序列合成由华大基因公司完成。华大基因公司使用内部软件分析dclk1碱基序列替换稀有碱基，cai值越接近1越好；将合成的dclk1碱基序列连入pcdna3.1真核表达载体，使用nhei(gctagc)和xho i(ctcgag)作为酶切位点；将质粒转化入感受态细胞dh5α中，使用含氨苄西林的固体琼脂平板来筛选阳性质粒；挑取单菌落并在含氨苄西林的培养基中大量扩增；随后提取质粒进行酶切鉴定及测序对比。
[0156]
2、dclk1 shrna的设计与构建
[0157]
dclk1 shrna由吉玛公司设计及构建，根据dclk1 cds区碱基序列构建了两条shrna：shdclk1-1和shdclk1-2，核苷酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示。
[0158]
3、质粒转染
[0159]
转染试验严格按照roche公司x-tremegene hp dna transfection reagent说明书要求进行操作。试验分为pcdna3.1空载组、pcdna3.1-dclk1组、shdclk1-1组、shdclk1-2组、和shnc组，每组均设3个重复(n＝3)。细胞转染质粒8h接种alv-j维持2h后弃掉毒液，换用含1％胎牛血清的dmem培养基继续维持72h，按照试验要求收获细胞。
[0160]
x-tremegene hp dna transfection reagent脂质体转染操作步骤：
[0161]
1)细胞培养：转染前细胞培养于12孔板，确保细胞保持最佳浓度和状态；
[0162]
2)试剂复温：x-tremegene hp dna transfection reagent、质粒和稀释液升温至20℃左右，混匀x-tremegene hp dna transfection reagent；
[0163]
3)溶液配制：使用opti-mem培养基作为质粒和转染试剂稀释液，1μg质粒dna加入100μl培养基，轻柔混匀。x-tremegene hp dna transfection reagent直接添加到含有稀释质粒的培养基中，质粒dna和转染试剂的比例为1：3，在此过程中，枪头切勿接触离心管管壁；使用的稀释剂体积多于100μl；
[0164]
4)孵育：转染复合物在20℃左右环境中孵育15min；
[0165]
5)转染：培养箱中取出的细胞，无需弃掉细胞培养板中原有培养基，将转染复合物直接滴加到细胞培养板中；
[0166]
6)alv-j感染细胞：质粒瞬时转染细胞8h后弃掉原有培养基，使用pbs洗涤3次，每孔加入600ml alv-j nx0101株毒液，37℃维持2h后弃掉毒液，加入含有1％胎牛血清的dmem培养基继续维持72h。
[0167]
4、细胞材料收集，细胞rna提取，rna逆转录为cdna，real-time pcr，蛋白浓度检测，western blot实验(同实施例1中2-7的操作)。
[0168]
结果如下：本实施例证明了过表达dclk1(图6a)在mrna和蛋白质水平上显着增强了alv-j的复制(图6b和6c)，相应地，敲低dclk1(图6d)在mrna和蛋白质水平上抑制了alv-j的复制(图6e和6f)，说明dclk1可以有效地促进alv-j的病毒复制。
[0169]
实施例5 dclk1对alv-j感染的df-1细胞周期影响
[0170]
为了探究dclk1是否通过影响细胞周期状态促进alv-j病毒复制，本实施例将dclk1过表达质粒和干扰质粒转染到alv-j感染的df-1细胞中，以验证dclk1对细胞周期的影响。
[0171]
1、细胞样品准备
[0172]
细胞培养与x-tremegene hp dna transfection reagent脂质体转染操作同实例3中步骤3；
[0173]
2、细胞收集
[0174]
1)小心收集细胞培养液到离心管内备用，用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞，再次收集到离心管内；
[0175]
2)3000rpm左右离心3-5min，沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液，以避免吸走细胞；
[0176]
3)加入约1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞，并转移到1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的pbs，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团；
[0177]
3、细胞固定
[0178]
1)加入1ml冰浴预冷70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定12小时；
[0179]
2)3000rpm左右离心3-5min，沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的70％乙醇，以避免吸走细胞；
[0180]
3)加入约1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的pbs，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团；
[0181]
4、染色
[0182]
配制溴化乙锭染色液，每管细胞样品中加入0.5ml，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min，避光存放；
[0183]
5、流式检测和分析
[0184]
用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用modfit分析软件进行细胞dna含量分析和光散射分析。
[0185]
结果如下：本实例证明过表达dclk1可以促进细胞周期从g1期向s期转化，并延长s期时间(图7a和7b)，进而促进alv-j的病毒复制，干扰则反之(图7c和7d)。