专利名称：对阳离子敏感的复合结构及其中使用的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及有荧光的香豆素并穴状配体离子载体及其合成和使用方法。这些离子载体可作为阳离子检测剂使用。本发明还涉及掺加了这些香豆素并穴状配位体离子载体的对阳离子敏感的复合结构，它们可用于连续检测。
各种流体中的离子组分的浓度测定已成为越来越普通的操作。一些环境试验步骤涉及频繁地、有时是连续地测定一种或多种金属离子(特别是重金属离子)的浓度。同样，某些医学诊断和治疗步骤涉及频繁、有时是连续地测定患者的一种或多种体液内的一种或多种离子的浓度。建立更好的连续试验方法的必要性已变得日益明显。极其需要对血液和其它体液中的血清钾离子(K+)作连续而快速的监测，尤其是在心脏分流手术期间。
曾报道过几种测定金属阳离子浓度的方法。其实例包括基于离子交换膜的检测，涉及使用试剂的分光光度和荧光技术，湿电极，以及基于离子载体的检测。但是，它们中有一些对测定碱金属离子浓度无效。通常用来测定碱金属离子浓度的方法中包括监测各种光学性质的方法。其中，测定荧光的方法优于以其它分光测量为基础的方法。利用荧光的方法的优点在于灵敏度和操作方便，这是由于激发(探针)和发射(信号)波长的固有分离。在美国专利4，808，539中介绍了用于体外阳离子浓度测定的化合物。
使用纤维光学化学传感器建立体内试验系统是众所周知的。例如，美国专利4，577，109中提到将化学传感器并入纤维光学波导管中，使得传感器能与被分析物相互作用并检测光学变化。美国专利5，037，615介绍了使用一对系留的荧光能量传递指示器作为纤维光学波导管中的化学传感器。美国专利4，929，561提到利用纤维光学监测由一个底物固定的荧光剂产生的信号，该荧光剂充分接近吸收剂物质，从而能发生共振的能量传递。美国专利4，822，746公开了利用纤维光学检测由生荧光物质与吸光的配位体和吸光的络合物组合成的体系发出的荧光。美国专利4，762，799叙述了在一个含有溶液的系统中用纤维光学检测荧光，该溶液中含有一种聚合的阳离子物质和有荧光的阴离子物质，通过一个半透膜与一种对于特定的碱金属离子有选择性的可动的离子载体接触。
已经提到过几种有可能适用于体内/体外使用的荧光方法。例如，已知由若丹明酯和部花青540作为荧光团、缬氨霉素作为离子载体构成的荧光探针。最近曾提到一种使用2，2-二[3，4-(15-寇-5)-2-硝基苯基氨甲氧基甲基]十四醇-14的纤维光学传感器，它以附着的若丹明-B作为荧光团，用以选择性地络合钾离子。此装置专门设计成用于体内。但是，它有若干局限性，包括染料-离子载体物种的可能迁出;可透性的控制(通过交联密度)必须在聚合时确定;可能发生酯键水解的不稳定性;以及基质的净电荷缺乏控制，如果不加补偿，它会导致欲测离子的道南排斥作用。
这些方法中有几种在对于生理浓度下碱金属离子的灵敏度和选择性方面问题甚多，特别是在生理PH下的水介质中。克服某些选择性问题的一种方法是例如德国专利3202779A1中所述的使用穴状配体与钾选择性络合。但是，这种方法的灵敏度受到限制;因为检测的手段是光吸收。另外，此方法必须在有机碱存在下在有机溶剂中进行，因此不适用于连续的血液测定或流体测定。在美国专利5，162，525中提到了一组以与各种穴状配体相结合的4-甲基香豆素部分为基础的发荧光的离子载体。这种[2，2，2]穴状配体衍生物的结构式
它对于钾离子有选择性，没有上述的选择性限制而且可以用来通过荧光测定钾离子浓度。
简要地说，本发明提供了一种具有通式A的荧光离子载体化合物其中，m和n各自独立地是0或1，R是一个吸电子的或可极化的基团，Z是氧或N-R”，其中R”是H或一个C1至C4烷基，该化合物在350-440nm的范围内有最大吸光度。
在另一方面，本发明提供了具有化学式B的双取代的芳族化合物 其中Y是氢或一个醛基，L选自氯、溴和碘，以及烷基磺酸酯基和芳基磺酸酯基。
在又一方面，本发明提供了一种阳离子敏感的复合结构，该结构包括底物和与之共价键合的(直接键合或通过连接基团)荧光离子载体化合物，该化合物具有上述的通式(式A)，其中R含有至少一个能与底物或连接基团中至少一个的官能基化学反应的官能度。(“直接键合”意味着式A中R的一个原子与底物表面上一个原子之间形成共价键。)在本发明的另一方面，提供了一种制备上述荧光离子载体化合物的方法，其中包括以下步骤a)将上述的双取代的芳族化合物(式B)与大约等摩尔数量的(a)和(b)中的一个缩合，得到以离去基团结尾的双乙氧基香豆素衍生物(a)一种通式为A-CH2-B的双官能亚甲基化合物，其中A是如上定义的R，或是它的直接的前体，B选自羧基和腈基，必要时此缩合反应可在有效数量的催化剂存在下进行，条件是上述的双官能芳族化合物的Y是醛基;
(b)通式如下的烯烃化合物 其中D和E各自独立地选自A和B，G是一个其中含有至少带一个孤电子对的原子的基团，R1是氢或低级烷基(即，有1-4个碳原子)，此缩合反应在路易斯酸存在下进行，条件是，上述双取代的芳族化合物中的Y是氢;
b)通过a)中的衍生物与大约等摩尔数量的二氮杂寇状化合物反应，生成离子载体化合物的穴状配体部分，从而得到荧光离子载体化合物。
在本发明的又一方面，提供了一种测定阳离子的存在和浓度的方法，其中包括以下步骤(a)形成一个如上所述的由彼此接触的荧光离子载体和含金属离子的介质构成的敏感复合结构，上述介质能传送离子，并且使离子扩散到敏感复合结构成为可能或提供了途径，以便与敏感复合结构的荧光离子载体形成平衡络合物，这种离子载体络合物在受到波长集中于λ1的光照射时，能发射出波长集中在λ2的光，λ2比λ1至少大10nm，而且λ1是在350和440nm之间;
(b)用波长λ1的光探询该络合物一段时间，使络合物足以发射出波长λ2的可见光，收集并检测之;以及(c)必要时将发射出的光与金属离子的浓度相关，以确定金属离子浓度。
在本申请中，除非另外指明，均采用以下定义“基团”或“化合物”或“部分”是指一个可供不干扰所要产物的常规取代基取代用的化学物种;
“香豆素并穴状配体”是指一个在6位和7位上已经苯并稠合了穴状配体的香豆素部分;
“烷基”是指在最长链中有1-30个碳原子的直链或支链有机基团;
“芳基”是指环状或稠合的环状体系，环中有5-15个碳原子或杂原子;
“芳族的”是指一个环或稠合的环体系，环中有5-15个碳原子或杂原子，环中的电子是非定域的;
“羧基”是指羧酸基团或其衍生物，包括例如酰基卤、酰基叠氮、酰胺、咪唑酰胺、酯和腈;
“探询”是指暴露在激发辐射源之下。
本发明提出了一种在Pb+2或Ba+2不存在的情况下对K+高度选择性的香豆素并[2，2，2]穴状配体离子载体，以及对于其它的一价和二价阳离子高度选择性的其它的香豆素并穴状配体。有利的是，本发明的[2，2，2]香豆素并穴状配体在水介质中使用时保持对K+的高度选择性。(高度选择性是指K+/Na+络合比至少为20∶1)，当本发明的离子载体的穴状配体部分与阳离子络合时，离子载体的光学性质的变化方式使得特定样品中的阳离子的浓度能通过荧光分析确定。
已对香豆素取代基及其在香豆素环中的位置进行了选择，以便保证本发明的离子载体的激发最大值处在从350nm到约440nm的一般范围。这意味着本发明的离子载体可以通过常规的玻璃光学来使用，这与美国专利5，162，525中提到的4-甲基化合物不同，据报道该化合物的激发最大值在约330nm。另外，与4-甲基化合物不同，本发明提出的取代基具有方便和稳定的(包括水解和受热两方面)连接底物的方式，因此本发明的离子载体容易结合到连续的接触血液的试验方法中。再者，4-甲基化合物在激发最大值下受连续辐照时，其荧光输出似乎急剧衰减(可能是由于甲基的光致氧化，这在有关的4-甲基香豆素激光染料中是常见的)，而本发明的离子载体显示出良好的荧光稳定性。
本发明的荧光离子载体具有上述的通式A·通过将R置于香豆素环的第3位上并且将其限于吸电子或可极化的基团，这些离子载体的最大吸光度的波长被提高到它们可以在采用常规玻璃光学的系统中使用的位置。
本发明的离子载体包括两个单元，它们合在一起可以选择性地识别阳离子。这些单元中的头一个含有一个穴状配体基团。这部分分子是与要分析的钾离子发生物理相互作用的单元。本领域的技术人员能辨别何种穴状配体的笼子在络合某种特定阳离子方面适用，但是也可以参考例如Lehn和Sauvage“[2]-穴状化合物碱金属和碱土金属大双环络合物的稳定性和选择性”，J.Am.Chem Soc97，6700-6707(1975)。由氧和氮原子限定的[2，2，2]笼的尺寸(约0.28nm)使得此单元对于有相近直径的阳离子(例如K+、pb+2、Sr+2和Ba+2)有相当强的选择性，[2，2，1]笼的尺寸(约0.21nm)使其对直径相近的离子(例如Na+和Ca2+)有相当强的选择性，而[2，1，1]笼的尺寸(约0.16nm)则使它对于诸如Li+和Mg+2等阳离子有高度选择性。(有利的是，当把这些香豆素并穴状配体结合到测量生理浓度的K+、Na+或Li+体系中时，不大象有浓度高到能干扰这些离子之一的分析的较重的金属存在。)在除K+外还含有其它离子的生理样品要定量分析[K+]的场合，这种尺寸选择性是关键的。根据被分析物的PH，穴状配体基团可以以单或双质子化的形式存在。在成桥的氮原子处发生的质子化不会显著影响香豆素并穴状配体在生理PH的范围内对K+的选择性(超过其它金属离子)，但是会影响香豆素并穴状配体物种的结合荧光强度。
本发明的离子载体的第二个特殊单元是在第3位上取代的香豆素基团。此单元可以看作是“报告”单元。以生理试验为例，当穴状配体笼内有质子或Na+存在时，香豆素单元有特征的荧光强度随波长变化图。当K+与穴状配体笼子的氧和氮原子形成络合物时，观察到荧光强度增强，换言之，钾络合物的形成提高了香豆素单元的荧光量子产率。同样的机制也适用于特定的穴状配体基团对其有选择性的其它阳离子。
在本发明中，香豆素单元的羰基官能度可以被一个亚胺官能度代替而不影响离子载体的性能。但是，如果本发明的分子在酸性的水相环境中使用，则亚胺官能度会水解成羰基。
香豆素单元的第3位是被吸电子基团或可极化基团R取代。与美国专利5，162，525(Masilimani等)不同，本发明要求荧光离子载体的香豆素部分在与羰基/亚胺基相邻的碳原子上被取代。由于将R置于此位置，本发明的离子载体比4位上取代的香豆素有稍高的(例如最多大20%)量子产率。这意味着可以使用强度降低的激发，从而减小了光致降解的可能性，并且能够使用强度较低的光源。另外还发现，将R只限于吸电子或可极化的基团产生了激发最大值充分红移(即在350-440nm的范围内)的离子载体，从而使它们可以藉助常规的玻璃光学系统使用，并且进一步减小了对光致降解的敏感性。
可以在本发明的离子载体中作为取代基使用的吸电子或可极化的基团，包括羧基、甲酰胺基、磺酰基芳基、酯基、酮烷基酯基和芳香基(优选在一个或多个位置上取代)。优选的R基包括酯基、酮烷基酯基和取代的芳香基，例如取代的苯基、苯并咪唑基、苯并恶唑基和苯并噻唑基。在酯基中，特别优选乙酯;在酮烷基酯中，特别优选-(CO)CH2CH2CH2(CO)OCH2CH3。优选的芳香基取代基包括胺、羧酸和磺酸。
在荧光分析期间由于在激发范围内的辐照而会发生光致氧化，与Masilimani等的实施例中提到的甲基相比，酯和酮烷基酯的羰基部分和取代的芳香基团的环发生光致氧化的可能性要小得多。另外，在取代基是取代的芳香基的场合，许多取代基可以提供方便的共价结合的部位;在取代基是酯或酮烷基酯的场合，这些基团的羧基部分在水解时同样提供了方便的共价结合部位。
本发明的香豆素并穴状配体离子载体的制备是以一个通用的方案为基础的，该方案提供了一种关键的中间体(上述式B)或它的最接近的前体(下面列出的反应示意图中的Ⅲ)，其L是一个例如卤素的离去基团(氟除外)和例如甲磺酰基、甲苯磺酰基和对溴苯磺酰基等烷基和芳基磺酸基。各种香豆素以及因此各种香豆素穴状配体，都可以从这一中间体出发用几种方法合成。
在实施例中使用了双氯乙氧基物质，但是如上所述，任何以离去基团结尾的双乙氧基-2-羟基苯甲醛均可使用。为制备双氯乙氧基关键中间体，选择1，2-双(2’-羟基乙氧基)苯作为起始物。此起始物可以根据Landini和Montanari在Synthesis，223-225(1978)中所述的方法制备。利用与过量的亚硫酰二氯反应将此起始物转化成1，2-双-(2’-氯乙氧基)苯(Ⅰ)(见实施例1)。然后令化合物Ⅰ与1，1-二氯甲基甲醚在氯化钛存在下反应，在水解时生成1，2-双-(2’-氯乙氧基)苯甲醛(Ⅱ)(见实施例2)。此化合物与过氧化氢和硫酸反应生成3，4-双-(2’-氯乙氧基)苯酚(Ⅲ)(见实施例3)。化合物Ⅲ随后在氯化钛存在下用1，1-二氯甲基甲醚处理，水解时生成上述的关键中间体(见实施例4)。
此中间体随后至少可以用两种不同的方法处理以得到6，7-双-(2’-碘乙氧基)-3-乙氧羰基香豆素(Ⅳ)。这里讨论的步骤提到制备酯取代的香豆素并穴状配体，但是本领域的技术人员容易看出如何能用中间体与和下面讨论的相似的化合物反应来制备有不同R基的香豆素并穴状配位体。
首先，此中间体能在哌啶或乙酸等催化剂存在下与丙二酸二乙酯反应，转化成6，7-双-(2’-氯乙氧基)-3-乙氧羰基香豆素(Ⅴ)，(见实施例5)。(也可以用不太优选的实施例6中的方法由化合物Ⅲ直接制备化合物Ⅴ。)化合物Ⅴ随后用碘化钠处理，得到化合物Ⅳ(见实施例7)。其次，此中间体可以通过与碘化钠反应转化成4，5-双-(2’-碘乙氧基)-2-羟基苯甲醛(Ⅳ)(见实施例8)。接着可以将化合物Ⅵ与丙二酸二乙酯在催化剂存在下缩合，得到化合物Ⅳ(见实施例9)。
化合物Ⅳ随后可以通过与1，4，10，13-四氧代-7，16-二氮杂环十八烷(即，4，13-二氮杂-18-冠-6)及碳酸钠反应，转化成6，7-[2，2，2]-穴状配体并-3-乙氧羰基香豆素(见实施例10)。
这些反应总结在下面列出的反应机理中。

为了得到用酮烷基酯或取代的芳基取代的香豆素并穴状配体，只需要在由关键中间体制备化合物的步骤中用适当的化合物代替丙二酸二乙酯(或者是，在由化合物Ⅲ制备化合物Ⅴ的步骤中代替二乙基乙氧亚甲基丙二酸酯)。
本领域的技术人员会认识到，非[2，2，2]品种的香豆素并穴状配体可以用与4，13-二氮杂-18-冠-6不同的二氮杂冠醚制备。例如，当要制备[2，2，1]香豆素并穴状配体时，可以使用1，4，10-三氧代-7，13-二氮杂环十五烷。
可以连接在香豆素单元第3位上的潜在的取代基提供了一种与其它分子和/或化学底物连结的方便手段。这些生荧光的离子载体可以直接地或通过分子链(即，连结基团)与底物连接，以便形成敏感组合物，随后可将它结合到连续感测或流通式装置中。
在本发明的离子载体通过这种连接基团与底物连结的场合，最长的连续链以含有5到125个碳和/或杂原子(例如氧、氮等)为宜，最好是含10到70个碳和/或杂原子，在它的至少一个末端带有一个自由官能度。这些连接基最好是亲水性的，以便不干扰金属离子与离子载体相互作用的能力。但是，如果希望连接基团对体系的某种不同的物理性质有贡献(例如疏水性，负电荷等)，或者底物充分亲水，则可以相应地选择重复单元和端基官能度。
可以将这些连接基团的官能度选择成能选择性地与香豆素并穴状配体的R基反应。可能的官能基包括胺、酰胺、酯、环氧乙烷、烯烃、脲、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、氨基甲酸酯、磺酰胺、磺酰氯、羧基、硅烷醇、氯三嗪、肼、酰肼和醛(或者是在与香豆素并穴状配体的R基反应时能生成胺、酰胺、酯、醚、脲、尿烷、磺酰胺、硅烷和酰肼的那些基团)。
连接基团最好在与离子载体反应之前先连接到底物上。这可以用两种方式中的一种完成。第一，它们可以在连接到离子载体反应之前先与底物反应。如果选择这一方式，每个连接基团必须是双反应活性的(即，在每个系链的每端都有一个官能基，它们可相同或不同)，而且底物必须有能与系链的官能基之一反应的互补官能度。第二，可以形成预先连结着连接基团的底物。这包括选择底物聚合物，使得连接基团事先附着于其上。
在本发明的离子载体要固定在底物上(即，直接地或通过连接基)以形成敏感复合结构的场合，可以使用各种形式的底物。在敏感复合物要包含在连续监测装置内的场合，平面底物可能较好，这仅仅是由于装置的尺寸和几何形状。
平面底物或容易做成平面的那些底物的实例包括(自立式)聚合物膜和可涂敷的聚合物(即，可以涂敷在载体上的聚合物)。可以由各种聚合物形成膜，包括聚乙烯、聚丙烯、聚偏二氯乙烯、聚氯乙烯(PVC)、聚砜、尼龙和二氧化硅(某些尼龙膜形成可逆性差的复合物，即，这种复合物只能在高和低的阳离子浓度之间使用几次循环，随后就慢慢停止显示强度随金属离子浓度的变化。)。这些膜最好是离子可透的，而且可任选地用那些与R(离子配体)的官能度互补并反应的基团官能化，或是已作过处理(例如空气氧化)，从而固有地带有这些基团。
为了使附着在膜表面处的离子载体的浓度尽可能地高，可能需要在连接离子配体之前先将膜的表面弄粗糙(例如含二氧化硅的膜)，或是使用多孔的膜。
水不溶性可涂敷的聚合物是优选的底物。这类聚合物包括PVC、PVC的共聚物和三元共聚物、苯乙烯和马来酸或马来酸酐的共聚物、烷基乙烯基醚和马来酸或马来酸酐的共聚物、乙烯基甲基吖内酯的聚合物和共聚物，以及丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯(或者丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺)与丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物。一旦本发明的离子载体已经与这些聚合物之一共价结合(直接地或通过连接基团)，即可任意地将聚合物-离子载体络合物铺展在上述的一种膜上。或者是，可以将可涂敷的聚合物涂布在膜上(必要时可与连接基团反应)，然后令其在本发明的离子载体中反应。无论用那一种方式，底物都是膜加上带有离子载体的可涂布的聚合物。
使用PVC聚合物或共聚物的另一优点是减小了香豆素并穴状配体的荧光响应的PH依赖性。例如，这种敏感复合结构在生理PH(7.3-7.5)和生理K+浓度(约4mM)下的荧光强度的变化仅为总荧光强度变化的约2%。
一种特别优选的复合结构是涂有已经与本发明的3-香豆素并穴状配体反应(直接地或通过连接基团)的PVC的成型膜。在市售的成型聚合物膜中，特别优选在PCT专利出版物WO92/07899中提到的亲水性多孔聚丙烯(HPPP)，因为它使得金属离子能不受障碍地接近离子载体，而对这些离子没有强的亲合力。这类复合结构可以任选地作成轧制的塞形。
本领域的技术人员会认识到，只需要选择一个对质子(或水合氢离子)选择性可透的膜，即可制得在各种浓度的金属离子存在下起PH传感器作用的复合结构。在金属离子的浓度保持恒定的情况下，可能不需要这种选择性的膜。
在使用流通式装置的情形，可以将固体复合结构磨成粉末(或者可以将香豆素并穴状配体化合物附着在市售的粉末或小珠上)或包封在一种对离子可透的基质(例如水凝胶、丙烯酰胺或丙烯酸酯型凝胶)中。如果复合结构是粉末(或者被磨成粉末)，在需要时可以将其粘结到平面底物上。
在需要连续探测时，尽管底物采用特定的几何形状，但是最好是不与在其附近的阳离子发生相互作用，或者可以发生可逆的相互作用(以便使离子容易与所附着的离子载体形成可逆的络合物)。为了将对阳离子/离子载体平衡的干扰减至最小，所选择的底物材料与阳离子相互作用的方式最好是这种相互作用的可逆性在阳离子浓度变化时不会有明显改变。底物本身最好不会与阳离子发生不可逆的反应或者吸附阳离子，有净的负电荷，而且是亲水的。如果所选择的底物不是固有地具备这些特性，可以将其改性使之具备。例如，可以与上述的连接基团一起结合上磺酸基或磷酸基，以便使组合物总地带负电并增加其亲小性。
在敏感组合物要用于的装置中若是阳离子必须穿过底物扩散以接近所附着的离子载体时，底物必须至少有一定的离子可透性或微孔性。另外，根据是否(以及如何)使用一个探询光束，可能需要提供半透明的或透明的底物，以及一个不透明的、反射的或者吸光的外涂层。典型的外涂层包括碳黑的聚合物分散体(涂敷在底物上)和墨水。
如果要定量测定分析物溶液中的阳离子浓度，则优选使用能测定平衡的离子-离子载体络合物浓度的分析技术。已发现光度方法特别适用。特别优选的是荧光。可以任意地对这样一种方法进行修改，以便能将纤维光学用在激发光和发射光的传送中。例如，可以使用一根或多根光学纤维引入波长范围集中在λ1的探询光，并且将波长范围集中在λ2的发射光传送到探测器。
本发明的荧光离子载体化合物可以用于需要测定特定阳离子浓度的多种场合。对K+或Na+有选择性的离子载体在测定这些离子的浓度方面(尤其是在生物体系中)特别有用。这些离子载体可以结合到现有的试验盒中，涂敷在各种底物上并装入以纤维光学为基础的分析仪器中。对Pb+2有选择性的离子载体可以用于环境试验，甚至或许生物试验中。将pka值(最好是去质子化物种的PKa)接近所关心的PH值的香豆素并穴状配体限制在装满适当缓冲的水的隔室内，隔室处在硅橡胶或类似的可透气膜包围之中(或者在膜之后)，则也可以测定[CO2](即，离子载体可以与CO2水化成H2CO3时生成的酸性物相互作用)。使用这些离子载体进行其它检测和浓度测定对于本领域的技术人员将是显而易见的。
以下实施例进一步说明了本发明的目的和优点。在这些实施例中提到的具体物质及其数量不应构成对本发明的不合理的限制。
实施例实施例1至10说明了制备6，7-[2，2，2]-穴状配体并-3-乙氧羰基香豆素(Ⅶ)的步骤。实施例11叙述了此化合物酯基的水解。
实施例1，2-双-(2’-氯乙氧基)苯将6g(0.03moL)1，2-双-(2’-羟基乙氧基)苯(按着Landini和Montanari的步骤制备)在400ml甲苯和6ml吡啶中的溶液在氮气下加热到40℃。在搅拌下于25分钟内加入过量的亚硫酰二氯(9.2mL，0.13moL)。将反应混合物加热到沸点(约110℃)，保持回流3小时。将溶液冷却到室温，然后倒出保存。残余物捣碎后溶在水中，用甲苯萃取。将甲苯溶液合并，先用2NHCl、然后用碳酸氢钠饱和溶液洗。干燥过的溶液减压蒸发，得到4.5g(64%)粗产物，将其在抽气泵的压力下用球形管蒸馏，得到4.43g分析纯的样品，熔点55°-56.5℃。光谱分析证实产物是1，2-双-(2’-氯乙氧基)苯。
实施例21，2-双-(2'-氯乙氧基)苯甲醛此步骤是Org.Synth.Coll.，第Ⅴ卷，49-51(1973)和Chem.Ber.，96，308-313(1963)中所述的合成三甲基苯甲醛的方法的变型。
将25g(0.11mol)实施例1的产物在60ml二氯甲烷中的溶液冷却到0℃。在氮气和搅拌下用注射器在30分钟内加入总计20ml(0.18moL)的四氯化钛(Aldrich化学公司;Milwaukee，WI)，其间将溶液保持在0℃的反应温度。在15分钟内于0℃下加入13.5g(0.117mol)1，1-二氯甲基甲醚(Aldrich产品)在10ml二氯甲烷中的溶液。在0℃下继续搅拌5分钟。在水浴将溶液温热20分钟，直到溶液达到室温。然后，将其回流15分钟。在溶液已经冷却之后，将它倒在碎冰上。在分液漏斗中摇荡此混合物之后，分离出二氯甲烷层;水层用两份100ml的氯仿萃取。将含氯烃溶液合并，依次用水和盐溶液充分洗涤。将有机层干燥，减压蒸发，得到24.5g乙醛(87%)，为辛辣的金黄色固体，熔点49°-51℃。光谱分析证实产物为1，2-双-(2’-氯乙氧基)苯甲醛。
实施例33，4-双-(2’-氯乙氧基)苯酚此化合物最初用Baeyer-Villiger氧化法制备，将实施例2中的苯甲醛用3-氯过氧化苯甲酸或单过氧邻苯二甲酸镁氧化成甲酸酯，接着进行酸催化的水解。但是在按比例放大时，此方法会由于分解而造成产物的毁灭性损失。因此，采用了另一种替代Baeyer-Vil-liger反应的方法。
将162g(0.616mol)实施例2的产物和1.5升冰水冷的(10℃)甲醇装入装有架空的搅拌器和冷却浴的2升烧瓶中。向此溶液中加入48g33%(重量)的预冷的硫酸溶液。
向125ml甲醇中加入94g(0.83mol)30%(重量)的过氧化氢溶液，在搅拌和继续冷却下将此混合物在5分钟内加到上述溶液中。所形成的溶液变混浊，但在搅拌2小时后澄清。
将此溶液从反应烧瓶的底上形成的褐色油(11g，丢弃)上倒出。倒出的溶液在室温下搅拌过液。从反应混合物中将甲醇去除，然后向粗产物中加入400ml氯仿和100ml水。搅拌此混合物。
在将各层分离之后，用氯仿进一步萃取水层。将氯仿层合并，用水洗至中性的PH。然后依次用30克(0.75mol)NaOH在400ml水中的溶液和同样配制的第二份200ml NaOH溶液萃取此有机层。将水相萃取物合并，用200ml 6N HCl酸化，用400ml新制备的氯仿萃取。将氯仿层在硫酸钠上干燥，流过一段5cm×5cm的硅胶柱。在除去溶剂后，得到84g(54%)浅褐色的固体。核磁共振氢谱证实了产物的结构。
实施例44，5-双-(2’-氯乙氧基)-2-羟基苯甲醛这一关键中间体用向实施例2中的1，2-双-(2’-氯乙氧基)苯引入醛官能度的方法制备。
在60ml二氯甲烷中依次用16.3ml(148mmol)四氯化钛和4.5ml(50mmol)1，1-二氯甲基甲醚处理12.4克(49.4mmol)实施例3的粗制酚，得到5.2g(37%)关键中间体。此产物在油泵的真空下升华，得到4.35g乳白色的晶体，熔点102°-102.5℃。光谱分析证实产物是关键中间体。
实施例56，7-双-(2’-氯乙氧基)-3-乙氧羰基香豆素(第一种方法)此方法是在实施例4的2-羟基苯甲醛上的标准的Knoev-enagel缩合，所根据的是Balaiah等Proc.Indian Acad.Sci，16A，68-82(1942)(化学文摘37，1429，1943);Borsche等，Chem.Ber，85，198-202(1952);Fukui等，Bull，Chem.Soc.Japan，35，1321-1323(1962)中的方法。
向6.03g(37.6mmol)丙二酸二乙酯(Aldrich产品)中加入10g(36mmol)实施例4产物，并彻底混合。将此混合物在氮气下于蒸汽浴上加热。在溶解之后，加入两滴哌啶。继续加热30分钟。然后将溶液冷却并用乙醇稀释，直到形成浆体。在过滤和空气干燥之后，得到11.5g(85%)褐色粉末。熔点102℃-103.5℃。核磁共振氢谱与实施例6的产物相同。
实施例66，7-双-(2’-氯乙氧基)-3-乙氧羰基香豆素(第二种方法)此方法以Bissel，Synthesis，846-848(1982)为根据，已证实是不稳定的，而且在成功时产率也低。它的一个优点是直接由实施例3的酚生成化合物Ⅴ，从而少一个步骤。
将一份0.9g(4mmol)的实施例3的酚与0.9ml(5mmol)的二乙基乙氧亚甲基丙二酸酯(Aldrich产品)混合。向此溶液中加入5ml MZnCl2/乙醚(Aldrich)溶液和40ml二氯甲烷。将溶液在氮气下回流24小时，在抽气泵的压力下在旋转蒸发器上减压蒸馏除掉溶剂，用水骤冷。用氯仿萃取此混合物。在一小段氧化铝柱上层析，用二氯甲烷作洗脱剂，得到0.33g(24%)产物。核磁共振氢谱表明产物为6，7-双-(2’-氯乙氧基)-3-乙氧羰基香豆素。
实施例76，7-双-(2’-碘乙氧基)-3-乙氧羰基香豆素(第一种方法)此方法依照美国专利5，162，525的实施例3用来制备相应的4-甲基衍生物的步骤。
将一份0.75g(2.0mmol)的实施例5的双-氯乙氧基香豆素和0.9g(6mmol)的碘化钠溶解在25ml丙酮中。将溶液在氮气下回流2天。然后补充加入0.45g碘化钠。将溶液再回流24小时(后来发现，使用甲乙酮代替丙酮可将总反应时间缩短至24小时)。加入最后的0.45g碘化钠。再继续回流6天。根据保持原来的反应体积的需要加入丙酮。将溶液冷却，减压蒸发。残余物用二氯甲烷和氯仿的混合物萃取。含有产物的含氯烃溶液用10%的硫代酸钠溶液洗(将形成的任何碘都还原成碘化物)，在硫酸钠上干燥，在旋转蒸发器上蒸发至干。残余物自乙醇中结晶，得到0.92g(82%)浅黄色的粉末，熔点164°-166℃。此产物的核磁共振氢谱与实施例9中的产物一致。
实施例84，5-双-(2’-碘乙氧基)-2-羟基苯甲醛此实施例提供了制备实施例9中双碘乙氧基香豆素衍生物(Ⅳ)的两种可选择的方法中的一种。
将2.21g(14.7mmol)碘化钠和1.37g(4.91mmol)实施例4的产物溶在20ml丙酮中。将溶液回流4天。然后加入10ml丙酮和第二份碘化钠(0.73g，2.6mmol)，将溶液再回流24小时。冷却溶液，过滤。在旋转蒸发器上除掉溶剂，残余物溶在氯仿中。用水洗氯仿溶液，然后用硫酸钠干燥，除掉溶剂后得到2.05g(89%)产物。核磁共振氢谱证实了产物的结构。
实施例96，7-双-(2’-碘乙氧基)-3-乙氧羰基香豆素(第二种方法)向1.73g(10.8mmol)实施例8的双碘乙氧基羟基苯甲醛中加入2.1g(4.6mmol)丙二酸二乙酯，将此混合物在蒸汽浴上加热。当混合物变得均匀时，加入两滴哌啶。在混合物冷却后，形成了沉淀。用几毫升乙醇稀释此溶液，在蒸汽浴上再加热至沸。在溶液汽冷却后，过滤得到沉淀产物。此产物为熔点162°-165℃的固体。核磁共振氢谱确认产物结构。
实施例106，7-[2，2，2]-穴状配体并-3-乙氧羰基香豆素使用美国专利5，162，525中相应的4-甲基衍生物的制备方法制备这种香豆素并穴状配体。
将1.0g(1.8mmol)双碘乙氧基香豆素(得自实施例7或9)和0.47g(1.8mmol(1，4，10，13-四氧代-7，16-二氮杂环十八烷(即，4，13-二氮杂-18-冠-6)分别溶在50ml一份的干燥乙腈。将合并的溶液(总计100ml)在5当量(0.94g)无水碳酸钠存在下于氮气下回流6天。在反应期间，粗的碳酸钠转化成极细的粉末。将冷却的溶液过滤，溶液减压蒸发至干。将残余物溶在二氯甲烷中，溶液过滤。用旋转蒸发器在抽气泵压力下蒸发二氯甲烷，接着在油泵压力下蒸发，得到黄色泡沫状物(大于计算产率的100%)。此粗产物在减活化的中性氧化铝上层析纯化，先用二氯甲烷洗脱未反应的起始物，接着用1-5%的乙醇/二氯甲烷混合物洗脱产物。回收到约为计算值50%的产物，基本上由所要产物(Ⅶ)构成。LRMSFAB(三乙醇胺)对C28H40N2O10计算出的m/e为564.27，而观测到的m/e为587，[ⅦC(Na)]+;未观察到游离[Ⅶ]+。紫外(磷酸盐缓冲液)λmax＝374nm，312nm.荧光(磷酸盐缓冲液)显示出λex＝371nm，λem＝453nm。
经层析法进一步纯化的类似制备的样品的结构得到核磁共振氢谱的证实。
实施例11实施例10的香豆素并穴状配体的水解。
将0.25g实施例10的产物样品溶在25ml 2N HCL中，在蒸汽浴上加热30分钟。根据需要加入少量甲醇以促进溶解。先在抽气泵的压力下于旋转蒸发器上、然后静止地在油泵真空下蒸走反应的挥发性组分(即，水、过量的HCL、醇)，得到南瓜黄色的固体3-羧基穴状配体并香豆素氢氯化物盐。核磁共振氢谱证实了是所要的产物。
实施例12-14叙述了另一种香豆素并穴配体的制备。
实施例126，7-双-(2’-氯乙氧基)-3-(1’-氧代-4’-乙氧羰基丁基)香豆素利用实施例5中叙述的方法，将2.12g(7.6mmol)实施例4的产物和1.76g(7.64mmol)3-氧代庚二酸二乙酯(Aldrich)在100ml乙醇中的溶液在蒸汽浴上加热。加入约20滴哌啶。将此混合物回流30分钟，冷却到室温。过滤分离出形成的沉淀，干燥后得到3.53g(96%)产物。产物的结构由核磁共振氢谱证实。
实施例136，7-双-(2’-碘乙氧基)-3-(1’-氧代-4’-乙氧羰基丁基)香豆素采用实施例7中叙述的方法，将3.5g(7.5mmol)实施例12的产物和3.4g(23mmol)无水碘化钠在300ml甲乙酮中的溶液在氮气下回流加热48小时。将混合物冷却到室温，用旋转蒸发器减压除掉溶剂。残余物用约20ml水处理。过滤分离出残留的固体并将其溶在甲苯中。在旋转蒸发器上减压去除甲苯以清除掉任何残留水分。将产物在高真空下干燥，得到4.5g(95%)目标产物。用核磁共振氢谱证实此产物的结构。
实施例146，7-[2，2，2]-穴状配体并-3-(1’-氧代-4’-乙氧羰基丁基)香豆素将实施例10中叙述的方法修改如下在一只装有磁搅拌器、回流冷凝器和氮吹洗源的250mL烧瓶中装入溶在干燥乙腈(45mL，在硅胶和0.4nm分子筛上干燥，自氢化钙中蒸馏)中的0.79g(1.3mmol)实施例13的产物。将1当量(0.33g)4，13-二氮杂-18-冠-6溶在第二份(20mL)干燥乙腈中，将此溶液加到第一个溶液中。将反应混合物加热到70℃，然后加入0.62g(5.8mmol)碳酸钠。将此溶液在氮气下回流7天，随后加入60ml氯仿，将溶液过滤。
在脱除了溶剂之后，得到约1g的黄色粘稠油状物。向此油中加入60ml氯仿和20ml盐水并混合之。分离出有机层，在硫酸钠上干燥。脱除溶剂，得到0.85g油状产物。将其先通过一个2cm×6cm的氧化铝粉末柱用闪蒸色谱法纯化(用70ml二氯甲烷作为洗脱溶剂)，留下了0.65g产物。然后将此物质小心地通过第二个氧化铝柱，使用1∶2的二氯甲烷/己烷混合溶剂洗脱，得到370mg(46%)基本上纯的产物，为发粘的黄色粉末。
使用核磁共振氢谱和红外光谱证实产物的结构。紫外光谱(磷酸盐缓冲液)结果λmax＝382nm，317nm.
实施例15香豆素衍生物的光稳定性比较使用以下模型化合物来鉴定香豆素的3和4位上官能度的变化对相对光稳定性的影响。配制化合物Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ在乙醇中的溶液，使其吸光度在0.05≤Amax≤0.1的范围内。将各溶液在一台SPEX Fluorolog 2TM系列分光荧光计(SPEX 工业公司;Edison，NJ)中在最大光源狭缝宽度(光谱通带30nm)和λmax下连续照射1小时。测得范围从30到50mW/cm2的激发源在样品处的发光度。在整个照射期间内在各溶液的发射极值波长下监测荧光强度。
相对于X规一化的数据列在下面的表1中(化合物Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ的光稳定性在一次实验中测定，化合物Ⅺ的在另一次实验中测定，但将结果合并在一个表内以便于比较)。
时间为零时的光强差异反映了衍生物的相对荧光效率。3-乙氧羰基衍生物(Ⅷ)兼有优越的光稳定性和比4-甲基衍生物(Ⅸ)或羧甲基衍生物(Ⅺ)略高的荧光效率。



实施例16实施例10的香豆素并穴状配体对生理浓度下[K+]的变化的响应用只含钠的磷酸盐缓冲液(20℃，PH＝7.36，[Na+]＝134mM，[K+]＝0mM，[CL-]＝64mM)配制实施例10的产物的约10-5M的溶液(A372nm＝0.1)。将每份36μL的[K+]＝0.2M的磷酸盐缓冲液加到置于小池内的3mL溶液中，使[K+]以2.4mM的间隔从0改变到12mM.在每一级都在400-600nm的范围内测定在270nm的激发波长下的荧光发射强度。
数据相对于在[K+]＝0mM和λ＝445nm下的光强作规一化处理。规一化的数据列在表Ⅱ中，它显示出荧光强强度随[K+]增加而有规律地增加。[Na+]增大到145mM只引起荧光的微小变化。对实施例14的产物得到了类似的结果。

实施例17带有分子系链的可涂敷聚合物的官能化在室温下将20g羧基化的聚氯乙烯(PVC-COOH聚合物，1.8%COOH，Aldrich公司)溶在1升四氢呋喃(THF)中。向此溶液中快速加入75ml的4.9g(3当量)二环已基碳化二亚胺(DCC)(Aldrich)在THF中的溶液。在一个带塞的烧瓶中将此混合物在室温下搅拌30-60分钟之后，将72g(10当量)的Jeffamine ED-900TM二(2-氨丙基)聚乙二醇800(Fluka化学公司产品;Ronkonkoma，NY)迅速加到活化过的聚合物溶液中，形成混浊溶液/悬浮液。将其在室温下搅拌18小时。在旋转蒸发器于60℃下将此溶液浓缩至约300ml，慢慢加到快速搅拌的装有约18升水的容器中(为避免生成小颗粒和为了形成容易过滤和纯化的聚合物沉淀，水必须作低剪切运动，即，涡动)。
从水中取出聚合物，用塑料筛片过滤，然后悬浮在约500ml甲醇中，再过滤。将聚合物悬浮在甲醇中并再过滤两次，以便在真空干燥之前减少残留的水和去掉反应副产物。
将聚合物在室温下再溶于约1升THF中并过滤，先经过一个聚丙烯滤布上铺着一厚层(3-4cm)Celite 545(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)硅藻土的聚乙烯布氏漏斗。收集透明的滤液，在旋转蒸发器上于60℃下浓缩至200ml。
如上所述地进行聚合物溶液在水中再沉淀和滤出聚合物。在水中切碎聚合物(用搅切器)后，真空干燥。
得到了这种官能化聚合物薄膜的红外光谱以证实反应(即，作为COOH基团特征的1720cm-1处的吸收消失)。聚合物的凝胶渗透色谱表明分子量与PVC-COOH起始物相比基本未变(即，160000至220，000，取决于PVC-COOH的批号)。
将Sarin等在Anal.Biochem.，117，147(1981)中的步骤如下修改以测定可利用的伯胺(来自二(2-氨丙基)聚乙二醇)的浓度。向试管中的20mg干燥的聚合物样品加入(a)0.40mL的苯酚和KCN在吡啶中的溶液和(b)0.10ml茚三酮在乙醇中的溶液(二者均按参考文献中所述配制)。用类似方式配制实验空白样。两个试管都在100℃下加热约10分钟，随后在冷水浴中冷却，接着各加入2mL四氢呋喃(THF)。在将各试管的内容物各自转移到25mL的容量瓶中后，用THF将其稀释到25mL。用紫外光谱法(λabs＝604nm)测定茚三酮的浓度，消光系数为1.2×104M-1cm-1。由此测得可利用的胺的浓度为0.2mmol/g聚合物。
实施例18化合物Ⅶ对可涂敷聚合物的附着将200mg实施例17的PVC/二(2-氨丙基)聚乙二醇样品溶在10mL二甲基甲酰胺(DMF)中。还配制50mg(约90μmol)水解的Ⅶ在2ml DMF中的第二个溶液。向此第二个溶液中加入42μL(0.27mmol)二异丙基碳化二亚胺(Aldrich)和40mg(0.27mmol)羟基苄基噻唑(Aldrich)，将此混合物搅拌约20分钟，然后加到头一个溶液中(用1mL DMF洗装有第二个溶液的烧瓶，以保证转移完全)。
向合并的混合物加入50μL(0.27mmol)二异丙基乙胺(Aldirch)。将其在氮气氛下搅拌过液。在40℃下用旋转蒸发器使溶剂的体积减小。在搅拌下将浓缩的溶液慢慢加到200ml水中。将水基悬浮液倒在80目的筛网上，收集絮凝的沉淀。将沉淀用水洗四次，用甲醇洗三次。在用刀片将沉淀切碎成细小的碎片之后，再在甲醇中洗三次。将此官能化的聚合物真空干燥。
使用茚三酮作为试剂的Kaiser等的方法(Anal.Biochem，34，595(1970))表明，系留的二(2-氨丙基)聚乙二醇的95%以上的胺基己经消耗，估计可能是通过与Ⅶ偶合。
实施例19官能化的聚合物在多孔膜上的涂敷用一个6英寸宽的狭缝送料刮刀式模头将实施例18的官能化聚合物在90/10(V/V)的THF和水的混合物中的2%(W/W)溶液挤压涂布在一卷(27.9cm宽，79μm厚)亲水性多孔聚丙烯(WO92/07899)上(亲水性多孔聚丙烯(HPPP)卷材的最大孔径为1.3μm，孔隙率77%)。卷材的速度为3m/min，溶液的给料速度为67mL/min。
使涂敷过的卷材通过一个气浮干燥室(15.6℃)以蒸发溶剂。最终形成的干涂层重量约为2.5g/m2。
暴露在0和8mM K+溶液中并计算响应百分数，结果表明在HPPP卷材的整个内孔表面积上已分布着一个不对称的官能化聚合物涂层，物质主要都加到膜与模头接触的一面上。
实施例20试验涂布过的膜从实施例19的带涂层的HPPP膜上冲切下园片。用它们试验敏感复合体的可逆性、PH依赖性和稳定性(在缓冲液中和在血液中)。
可逆性传感器对钾离子浓度变化的可逆性通过用一台CDITMS400监测器(CDITM/3M Health Care，Tustin，CA)测量传感器的荧光强度来确定，此监测器装有一个395nm的激发源并检测波长大于440nm的荧光。钾离子浓度通过快速循环一个含有约138mM NaCl的50mMN-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(乙磺酸)缓冲液(Sigma化学公司，St.Louis，MO，以后称其为HEPES)来改变的，向此缓冲液中加入足量的KCl使[K+]为2、4、6或8mM。在平衡8分钟后测量荧光强度，但是实际的传感器响应时间(对于分析物的K+浓度的变化)很短(即，约30到120秒)。这些测量的结果列在表Ⅲ中。

表Ⅲ表明，实施例19中制备的传感器对于比分流手术期间通常观察到的(即，3到6mM)还要高的钾离子浓度的变化是可逆的。
PH-依赖性用CDITMS400监测器测定在K+浓度为2、4和6mM时传感器荧光强度随上述HEPES缓冲液的PH的变化。这些测量的结果列在表Ⅳ中。

表Ⅳ表明，实施例19制备的传感器随PH变化(尤其是在生理PH范围)显示出的响应(对变化的[K+])变化很小。更具体地说，传感器在生理PH范围(即，约7.3到7.5)内和生理钾离子浓度(即，约4mM)下的荧光强度的变化约为从PH＝7.07到PH＝7.90所观察到的总荧光变化的2%。作为比较，与非PVC基质结合的同样的香豆素并穴状配体在相同PH范围的缓冲剂水溶液中的PH依赖性约为6%或更大，而对于未固着的香豆素并穴状配体，其PH依赖性甚至更大。
稳定性在缓冲液和血液中测定敏感复合件的稳定性。
A.缓冲液50mM的HEPES溶液，用AVL 9120TM钠/钾分析器(AVL科学公司，RoswelL，GA)测得含有138mM NaCL，将它在LaudaTMRC20恒温水浴(Lauda Dr.R.Wobser GmbH Co.KG，德国)中保持24℃的恒定温度，并且用一台13400型蠕动泵(Sarns/3M Health Care，Ann Ar-bor MI)通过一个传感器回路循环。用OrionTMPH计(Orion Research，Cambridge，MA)监测溶液的PH，其范围为7到8。用一台高级宽程渗透计3W2TM(Advanced仪器公司，Needham Heights，MA)测量溶液的重量摩尔渗透压浓度，其范围是从285到305mOsm(渗透压摩尔)。缓冲液的[K+]用一台IL643TM火焰光度计(InstrumentaL Laboratories，Lexington，MA)测定。
进行两组[K+]“阶进”实验(均在室温)。第一组，[K+]在0和8mM之间交替变化。实施例19中所述的敏感复合物在与8mM溶液接触之前先与0mM KCl溶液平衡，随后令此敏感复合物在新的[K+]下平衡5到10分钟(虽然完全平衡相当快)。在5小时的时间内重复此过程5次。在整个实验期间内两溶液的荧光强度基本上保持不变(即，用CDITMS400监测器测得0mM溶液约为488次计数，8mM溶液约567次计数)。
第二组“阶进”实验中的[K+]为3和7mM，这是用IL643火焰光度计测得的在分流手术中通常遇到的浓度范围。敏感复合物在与7mM溶液接触之前先与3mM kcl溶液平衡，然后令其与新的[K+]平衡几分钟(虽然在大约90秒内即达到完全平衡)。在大约3个半小时内重复此过程5次。在整个实验期间两个溶液的荧光强度均保持基本不变(即，用CDITMS400监测器得3mM溶液约为647次计数，7mM溶液约为677次计数)。
B.血液按着前面的说明，将牛血调节成[Na+]为138mM，重量摩尔渗透压浓度为300mOsm。如上所述，通过加入kcl使钾离子浓度达到3和9mM.利用连续地喷入成分为2.8% CO2、5.5%O2和91.7%N2的气体，使得用ABL-4TM血液气体分析代(Radiometer A/S;Copen-hagen，丹麦)测得的血液的PH保持为约7.34±0.02。血液溶液贮存在恒温水浴中，在加到试验回路中之后，用蠕动泵循环(见前节)。将传感器固定在CDITMS400盒和CDITM6730Quik-cell型血液气体监测装置(尺寸3/8英寸)上(CDI/3M Health Care公司)。
为了交替变换两种[K+]溶液，用3mM溶液得到初始的传感器强度，在直接引入9mM溶液之前先将试验回路排空。当这一过程倒转时，要用[K+]＝3mM的血液洗涤液冲洗试验回路，以防止3mM试验溶液的污染(此洗涤过程使传感器在血液溶液变换之间暴露于空气中，这会造成传感器的响应时间变长。已发现将传感器在一个含8mMK+和少量诸如TritonTMx-100或TweenTM80等表面活性剂的HEPES缓冲液中水化，会产生稳定的传感器强度。TritonTMx-100和TweenTM80皆可自Aldrich公司得到，最好是用后者，因为它已被批准用于内服药物。)。
若是在改变血液溶液之间不使用中间的洗涤，则当[K+]从3变至9mM时，响应时间(95%)约为40秒，从9变至3mM时，响应时间约为65秒。
传感器在大约5小时的时间内显示出良好的稳定性。在试验过程中9mM溶液产生的强度略有减小(即，约5次计数)，但据信这是由于此溶液被替换它的3mM溶液稀释之故。
本领域的技术人员显然可以作出不偏离本发明的范围和精神的各种修改和变动。本发明不应受本文陈述的说明性实施例的限制。
权利要求
1.一种通式如下的荧光离子载体化合物 其中m和n各自独立地为0或1，R是一个吸电子基团和一个可极化基团中的至少一个，Z是氧或N-R”，其中R”是H或一个C1至C4烷基，所述的化合物在350至440nm的范围内有最大吸光度。
2.权利要求1的离子载体化合物，其中R选自羧基、甲酰胺基、取代或未取代的磺酰芳基、酯基、酮烷基酯基以及取代或未取代的芳香基。
3.权利要求1的具有以下化学式的离子载体化合物
4.化学式如下的一种化合物 其中Y选自氢和醛基，L是一个离去基团，选自氯，溴、碘以及烷基磺酸基和芳基磺酸基。
5.一种对阳离子敏感的复合结构，它由一个底物和权利要求1的荧光离子载体化合物构成，其中离子载体化合物以键或连接基团的方式通过上面定义的R与底物共价结合，该连接基团在两端均有官能度，连接基团一端的官能度与R的官能度是互补的，另一端的官能度则与底物的官能基互补。
6.根据权利要求5的敏感复合结构，其中连接基团的官能度各自独立地选自胺、酰胺、酯、环氧乙烷、烯烃、脲、硅烷醇、氨基甲酸酯、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、磺酰胺、磺酰氯、羧基、氯三嗪、肼、酰肼和醛等基团。
7.根据权利要求5的敏感复合结构，其中的底物包含一种聚合物材料，它必要时可涂布在膜上。
8.一种制备权利要求1的荧光离子载体化合物的方法，其中包括以下步骤a)将以下的化合物1)和2)缩合，得到一个离去基团取代的双乙氧基香豆素衍生物1)化学式如下的一种双取代的芳族化合物 其中Y选自氢和醛基，L是一个离去基团，选自氯、溴、碘以及烷基磺酸酯基和芳基磺酸酯基;2)大致等摩尔数量的(a)和(b)中之一(a)通式为A-CH2-B的双官能的亚甲基化合物，其中A是R或它的直接前体，R的定义如前，B选自羧基和腈基，此缩合反应必要时可在有效数量的催化剂存在下进行，条件是双取代的芳族化合物的Y是醛基;b)通式如下的烯烃化合物 其中D和E各自独立地选自A和B，G是一个其中含有一个有至少一个孤电子对的原子的基团，R’是氢或低级烷基，此缩合反应在路易斯酸存在下进行，条件是双取代的芳族化合物的Y是氢;b)通过a)中的香豆素衍生物与近似等摩尔数量的二氮杂冠状化合物反应，生成离子载体化合物的穴状配体部分，从而得到荧光离子载体化合物。
9.一种检测阳离子存在的方法，包括以下步骤a)形成根据权利要求5的敏感复合结构，该结构包含彼此接触的荧光离子载体化合物和含阳离子的介质，该介质能传送离子，并且使阳离子扩散到敏感复合结构成为可能或提供了途径，以便与敏感复合结构中的荧光离子载体化合物形成平衡的络合物，这种离子载体化合物络合物在受到波长范围集中在λ1的光的照射时，能发射出波长范围集中在λ2的光，λ2比λ1至少大10nm，λ1在350到440nm之间;b)用波长范围集中在λ1的光探询上述络合物一段时间，使络合物足以发射出波长λ2的可见光，收集并检测之;以及必要时c)将发射光与要测定的阳离子的浓度相关联，以确定阳离子浓度，必要时可以利用至少一根光学纤维将波长范围集中于λ1的探询光引入和将波长范围集中于λ2的发射光传送到检测器。
10.权利要求9的检测阳离子存在的方法，其中还包括以下步骤d)在荧光离子载体化合物和含阳离子的介质之间形成一个透气的薄膜，荧光离子载体化合物被限制在与含阳离子的介质相对的透气薄膜另一边的水相环境中。
全文摘要
一种荧光离子载体化合物包含一个穴状配体部分和一个在第3位上被一个吸电子基团或可极化基团取代的香豆素部分。此化合物显示出良好的光稳定性，可以通过合适部位的共价结合并入到对阳离子敏感的复合结构中，该结构可用于生物和环境试验，并且可以藉助常规的玻璃光学使用。
文档编号C07C47/575GK1106407SQ9411711
公开日1995年8月9日 申请日期1994年10月14日 优先权日1993年10月21日
发明者J·E·特伦德, C·A·基普克, M·A·罗斯曼, M·雅福索, S·L·帕迪尔 申请人:明尼苏达州采矿制造公司