polya聚合酶活性检测方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及polya聚合酶活性检测方法。


背景技术：

2.polya聚合酶(poly(a)polymerase，缩写pap)是一种可以对单链rna 3
’‑
oh末端加尾的聚合酶，在mg
2+
和atp存在的情况下，其能够通过以不依赖模板的方式，对单链rna的3
’‑
oh末端偏好性地添加三磷酸腺苷(ratp)，可以对rna加至少20个a(即加尾活性)。pap被广泛应用于分子生物学研究和生物医药领域，如二代测序中对mirna加poly(a)尾巴，以利于下游对mirna进行扩增富集；或在一些rna疫苗制备过程中，会使用pap添加poly(a)尾巴，以减少下游操纵中rna疫苗的降解。
3.对于分子生物学研究和生物医药领域而言，pap的活性是影响后续实验结果或试剂稳定性和可靠性的关键因素之一，因此检测和保证pap的活性水平十分重要。
4.目前pap活性检测方法主要有：(1)放射性同位素的方法，在活性反应过程中使用同位素3h标记的ratp，通过检测产物的放射性强度，反映pap的poly(a)加尾活性；(2)单链rna毛细管电泳法，使用cy5、fam或其它荧光素标记的单链rna直接进行pap活性反应，然后使用毛细管电泳的方法检测单链rna长度变化，最终确定pap所加poly(a)尾巴长度，以此确定pap活性。但上述方法分别存在以下问题：(1)放射性同位素对人体和环境有毒害作用，操作过程十分繁琐；(2)单链rna毛细管电泳法直接使用荧光标记的单链rna，但在操作过程中，由于rna极易降解，因而会导致结果不稳定。因此亟需开发一种方便快捷、安全可靠的polya聚合酶活性检测方法。polya聚合酶活性检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种新型的polya聚合酶活性检测方法。
6.为了实现本发明目的，本发明提供一种polya聚合酶活性检测方法，包括以下步骤：
7.(1)利用待测polya聚合酶对rna模板进行加尾反应；
8.(2)加尾反应结束后，使用逆转录引物进行逆转录反应；
9.(3)获取所述逆转录反应得到的cdna的长度；
10.(4)将cdna长度数据带入基于polya聚合酶标准品建立的polya聚合酶(酶活-cdna长度)标准曲线中，得到所述待测polya聚合酶的酶活性。
11.前述的方法，所述rna模板3’端不含有碱基a，且长度大于等于15nt。
12.优选地，所述rna模板内部不含有15个以上的碱基a，且不含有gc组成的回文或重复序列。
13.更优选地，所述rna模板的长度为20～25nt。
14.前述的方法，所述逆转录引物为5’端带荧光标记的oligo(dt)n，n与所述rna模板的碱基个数相同。
15.优选地，所述荧光标记选自fam、cy3、hex或tamara等，优选fam。
16.例如，所述rna模板为5
’‑
ccucacugcucucucugucagc-3’，所述5’端带荧光标记的oligo(dt)n中n＝22。
17.所述polya聚合酶标准品可以是商品化pap，如neb公司的pap酶或北京全式金生物技术有限公司的pap酶。
18.所述待测polya聚合酶包括但不限于由工程菌表达的polya聚合酶。
19.前述的方法，步骤(4)获取所述逆转录反应得到的cdna的长度具体包括：将所述逆转录反应的产物进行毛细管电泳，然后利用如下式i、式ii或最长加尾长度参数确定cdna的长度：
20.l＝p
test-p
ck
ꢀꢀꢀ
式i
21.其中，l为加尾长度，p
test
为各实验组cdna主要出峰位置，p
ck
为阴性对照；
22.l’＝p
max-p
ckmax
ꢀꢀꢀ
式ii
23.其中，l’为加尾长度，p
max
为峰最高强度对应的出峰位置，p
ckmax
为阴性对照峰最高强度对应的出峰位置；
24.所述最长加尾长度参数是指在毛细管电泳的检测极限内，测得的最长加尾长度。
25.前述的方法，步骤(4)中标准曲线的建立方法包括：
26.1)将polya聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的polya聚合酶标准品；
27.2)利用梯度酶活性的polya聚合酶标准品分别对rna模板进行加尾反应；
28.3)加尾反应结束后，使用逆转录引物进行逆转录反应；
29.4)获取所述逆转录反应得到的cdna的长度；
30.5)根据cdna长度数据与polya聚合酶酶活性的对应关系建立标准曲线。
31.前述的方法，所述逆转录反应结束后，还包括降解rna模板的步骤。
32.优选地，采用核糖核酸酶h降解rna模板。
33.前述的方法，降解rna模板后，还包括失活酶(核糖核酸酶h)的步骤。
34.本发明还提供一种检测polya聚合酶活性的试剂盒，包括rna模板和逆转录引物。
35.所述rna模板3’端不含有碱基a，且长度大于等于15nt；优选地，所述rna模板内部不含有15个以上的碱基a，且不含有gc组成的回文或重复序列；更优选地，所述rna模板的长度为20～25nt。
36.所述逆转录引物为5’端带荧光标记的oligo(dt)n，n与所述rna模板的碱基个数相同。
37.进一步地，所述试剂盒还包括polya聚合酶标准品。
38.优选地，所述试剂盒还包括加尾反应试剂、逆转录反应试剂和/或核糖核酸酶h。
39.进一步地，加尾反应的条件为：37℃反应5～60min。
40.进一步地，使polya聚合酶失活的条件为：65℃处理5min。
41.进一步地，逆转录反应的条件为：37℃～55℃(优选42℃)反应30～120min。
42.进一步地，降解rna链的条件为：37℃处理2min。
43.进一步地，使酶失活的条件为：85℃处理5min。
44.在本发明的一个具体实施方式中，polya聚合酶活性检测方法包括以下步骤：
45.s1、配制不同浓度的pap酶标准品溶液作为实验组，分别为5u/μl、1u/μl、0.5u/μl、
0.25u/μl、0.125u/μl和0.05u/μl，以不加入pap酶为阴性对照；
46.s2、配制如下体系i进行加尾反应；
47.体系i：pap酶标准品溶液1μl，10
×
加尾反应缓冲液2μl，10mm atp 2μl，200ng rna模板1μl和ddh2o 13μl；于37℃反应10min，然后于65℃处理5min使pap酶失活；
48.s3、配制如下体系ii进行逆转录反应；
49.体系ii：上一步的加尾反应产物5μl，5
×
逆转录反应缓冲液4μl，200mm dtt 1μl，10mm dntps 1μl，10μm 5
’‑
fam标记的oligo(dt)
22 1μl，8μm逆转录酶1μl和ddh2o 7μl；于42℃反应60min，然后向反应产物中加入5u/μl rnaseh 1μl，于37℃反应2min降解rna链；最后于85℃处理5min使酶失活，所得产物进行毛细管电泳并使用genemarker软件分析片段长度；
50.s4、利用如下式i或者式i+式ii或者式i+式ii+最长加尾长度参数进行酶活性的评估：
51.l＝p
test-p
ck
ꢀꢀꢀ
式i
52.其中，l为加尾长度，p
test
为各实验组cdna主要出峰位置，p
ck
为阴性对照；
53.l’＝p
max-p
ckmax
ꢀꢀꢀ
式ii
54.其中，l’为加尾长度，p
max
为峰最高强度对应的出峰位置，p
ckmax
为阴性对照峰最高强度对应的出峰位置。
55.所述最长加尾长度参数是指在毛细管电泳的检测极限内，测得的最长加尾长度；
56.s5、建立反映片段长度和pap酶标准品溶液浓度之间关系的标准曲线；
57.s6、以待测polya聚合酶代替步骤s1～s4中的pap酶标准品，按照步骤s1～s4中的方法，获得产物的片段长度，并代入步骤s5的标准曲线中，计算出待测polya聚合酶的活性。
58.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
59.(一)本发明提供一种pap酶活性检测方法，使用oligo(dt)和逆转录酶进行反应，进行逆转录后以含有荧光标记的cdna作为检测物，结果更稳定。
60.(二)本方法无需放射性同位素标记，更为安全环保。
61.(三)本方法操作步骤简单，普通实验室即可完成操作。
62.(四)本方法能够充分、直观地反映polya聚合酶加尾规律和数量的细节，而非整体数值总和，能够细节性地展示polya聚合酶的催化效果。
附图说明
63.图1为本发明较佳实施例中pap活性检测原理图。其中，rna为人工合成rna；cdna为逆转录后所得；多角星指荧光标记。
64.图2为本发明较佳实施例中毛细管电泳结果图。其中，上方横向坐标代表毛细管电泳分析认定的片段长度；纵坐标为信号值强度，即峰高。a，neb原始酶液(5u/μl)；b，neb酶液稀释5倍；c，neb酶液稀释10倍；d，neb酶液稀释20倍；e，neb酶液稀释40倍；f，neb酶液稀释100倍；g，阴性对照。
65.图3为本发明较佳实施例中不同批次重组大肠杆菌pap酶活性的毛细管电泳检测结果图。其中，上方横向坐标代表毛细管电泳分析认定的片段长度；纵坐标为信号值强度，即峰高。e1-e3为不同批次的pap酶，c1为阴性对照。
66.图4为本发明较佳实施例中最长加尾长度与酶活的对应散点图。其中，横坐标为酶活，单位为u/μl，纵坐标为最长加尾长度，单位为nt。方程y＝333.91x+24.645为0.125u/μl～1u/μl范围内最长加尾长度与酶活的拟合曲线。
67.图5为使用活性已知的一种商品化pap酶的毛细管电泳检测结果图。其中，上方横向坐标代表毛细管电泳分析认定的片段长度；纵坐标为信号值强度，即峰高。nt为全式金生物科技有限公司的pap酶稀释5倍，ck1为阴性对照。
具体实施方式
68.本发明提供一种非放射性而便捷的新型pap酶活检测方法，该方法所得数据结果更稳定，且能更直观地展示pap酶的加尾规律。
69.本发明采用如下技术方案：
70.人工设计并合成一条mirna序列(rna模板)，使用pap酶进行加尾反应，之后使用逆转录酶进行逆转录，所用逆转录引物为荧光标记的oligo(dt)，oligo(dt)能够与足够长的poly(a)(如大于15nt)在任意位置结合，进行充分逆转录反应后，所得cdna长度能够如实地反应pap酶的加尾活性和规律，使用rnaseh消化mirna，进行毛细管电泳(图1)。
71.具体而言，上述人工合成的mirna可以是任意的20nt序列，但需满足其3’末端不含有a，内部不含有15个以上的a，且不含有gc组成的回文或重复序列，否则会影响后续逆转录反应。
72.所用pap酶来源于大肠杆菌e.coli，具体而言，使用neb公司的pap酶或北京全式金生物技术有限公司的pap酶。
73.所用逆转录酶使用北京擎科生物科技有限公司的逆转录试剂盒进行。
74.所用荧光标记的oligo(dt)，具体长度为22nt，即5
’‑
tttttttttttttttttttttt-3’；所用荧光标记可以为，但不限于fam、cy3、hex或tamara等中的任意一种，偏好性的使用fam；荧光标记的位置为oligo(dt)的5’末端。
75.所用oligo(dt)长度必须与所用mirna长度一致。
76.所用rnaseh来源于大肠杆菌e.coli，具体而言，使用全式金公司的rnaseh。
77.具体反应条件如下：依次加入合成的种合成的反应缓冲液、mirna和pap酶，37℃反应5～60min，为更好地显示酶活差异，偏好性地选择10min；所用mirna总量可以为50～1000ng，为保证能够可观显示加尾规律，并保证后续逆转录反应的充分进行，偏好性地使用200ng；加尾反应结束后，65℃加热5min失活pap酶；随后加入逆转录反应各组分，反应温度为37℃～55℃，为确保mirna不含有二级结构，并保证oligo(dt)能够与mirna正确结合，优选42℃进行反应；逆转录反应时间为30～120min，为保证逆转录反应充分进行，并考虑时间成本，优选60min进行。反应后，加入rnaseh(全式金)，37℃处理2min；85℃加热5min，失活逆转录酶和rnaseh。所得产物进行毛细管电泳。
78.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
79.实施例1 pap酶活检测
80.本实施例设置以下组别：a组，pap原始酶液(购自neb，5u/μl)；b组，pap原始酶液稀
释5倍；c组，pap原始酶液稀释10倍；d组，pap原始酶液稀释20倍；e组，pap原始酶液稀释40倍；f组，pap原始酶液稀释100倍；g组，阴性对照；阴性对照为不加入pap酶的实验组。依次加入合成的mirna：5
’‑
ccucacugcucucucugucagc-3’，pap酶(neb公司)反应10min进行加尾反应，反应温度为37℃；之后65℃加热5min。
81.随后进行逆转录反应，所用逆转录引物为5
’‑
fam标记的oligo(dt)
22
，反应温度为42℃，反应时间为60min；反应后，加入rnaseh(全式金)，37℃处理2min；85℃加热5min，失活逆转录酶和rnaseh。oligo(dt)能够与足够长的poly(a)(如大于15nt)在任意位置结合。在一定条件下(即逆转录组分充足、逆转录条件适宜和逆转录反应时间充分)，逆转录反应所得cdna能够最大程度体现poly(a)的长度。
82.各反应具体配置方案如表1～表2所示：
83.表1 pap加尾反应体系
[0084][0085]
37℃反应10min；然后65℃处理5min。
[0086]
表2逆转录反应体系
[0087][0088]
42℃逆转录反应60min后，加入5u/μl rnaseh 1μl，37℃处理2min；然后85℃处理5min。
[0089]
逆转录所得cdna，送往天津擎科生物科技有限公司进行毛细管电泳检测，内标选择liz-120(thermo)。所得毛细管电泳结果使用genemarker软件进行分析。
[0090]
实施例2 pap酶活性的评估
[0091]
由于pap酶的加尾长度近似符合正太分布，在毛细管电泳所得结果中，片段长度以峰形曲线形式展现。p
test
指各实验组cdna主要出峰位置通常是一个范围，此处的主要出峰位置指以峰形最高信号强度的10％作为主要峰形的左右边界进行限定的峰形范围。主要出峰位置作为pap酶活性比较的一个重要指标(第一个评估参数)，所用阴性对照为5
’‑
fam标记的oligo(dt)
22
，与mirna长度相同，因此毛细管电泳结果中加尾长度可按照式i计算：
[0092]
l＝p
test-p
ck
ꢀꢀꢀ
式i
[0093]
其中，l为加尾长度，p
test
为各实验组cdna主要出峰位置，p
ck
为阴性对照。
[0094]
第二个评估参数用于辅助评判加尾活性，计算公式如式ii所示：
[0095]
l’＝p
max-p
ckmax
ꢀꢀꢀ
式ii
[0096]
其中，l’为加尾长度，p
max
为峰最高强度对应的出峰位置，p
ckmax
为阴性对照峰最高强度对应的出峰位置。
[0097]
第三个评估参数是最长加尾长度，即在毛细管电泳能够的检测极限内，所观测到的最长加尾长度。
[0098]
以neb的pap为例，其已知活性为5u/μl，对其进行梯度稀释，使用毛细管电泳进行检测，结果如图2和表3所示：
[0099]
表3毛细管电泳检测酶活性总结
[0100][0101]
由以上数据可知，随着酶的稀释，l，l’以及最长加尾长度均在不同程度发生变化。以neb公司的pap酶为参比，可以确定重组表达生产的pap酶的活性。此外，该方法在0.125u/μl～1u/μl范围内，最长加尾长度与酶活呈良好线性关系(图4，r2＝0.9839)。使用全式金生物科技有限公司的pap酶(浓度为5u/μl)进行验证，稀释5倍后，其最长加尾长度约为360nt(图5)，利用用公式所得酶活计算值为1.006u左右，与稀释后实际值1u/μl非常相近，表明该方法的可行性。
[0102]
实施例3在不同批次重组大肠杆菌表达的pap酶的批间差实际检测中的应用
[0103]
使用neb公司的pap酶作为参照，评估不同批次重组大肠杆菌表达的pap酶的批间差，具体实验方法同实施例1，即将不同批次的pap酶进行加尾反应和逆转录反应，之后进行毛细管电泳检测。结果如图3和表4所示，e1-e3为不同批次的pap酶，c1为阴性对照，三个批次存在细微差距，其中e3与其余两个批次在加尾长度上区别更为明显。同时可以估测e1-e3三批pap酶的活性约为1u/μl～5u/μl之间。利用实施例2中的公式进一步计算，估测其活性均约为1u/μl。
[0104]
表4不同批次毛细管电泳检测酶活性
[0105][0106]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。