1.本申请涉及植物伤口的愈合领域，具体而言，涉及一种根瘤菌属的菌株、其制备的菌剂及在植物伤口愈合中的应用。


背景技术：

2.植物修剪、移栽以及田间操作过程中都会造成大量伤口，而这些伤口若不进行妥善处理，会导致植物体内营养成分的流失，或者细菌、真菌等病原菌随伤口入侵植物体内，其结果致使树势衰弱甚至死亡，如何促进植物伤口快速愈合是一项重要的工作。
3.目前，生产应用中所使用的植物伤口愈合剂含有大量化学试剂，包括杀菌剂、营养剂和保护剂，这些化学成分容易造成环境污染，而且市售伤口涂抹剂中所含的高分子成膜剂多为聚丙烯酰胺、丙烯酸酯、水性聚氨酯、改性环氧树脂等，这些成膜剂均对植物形成层细胞具有一定的毒性,影响植物的健康生长。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种根瘤菌，该根瘤菌菌株命名为11760，其分类学命名为根瘤菌rhizobium sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间为2018年02月08日；保藏编号为：cgmcc no.15351。
5.本发明还提供一种细菌菌剂，该菌剂由前述的根瘤菌菌株11760制备而成。
6.优选的，该菌剂中菌株11760活性菌数量≥108cfu/ml。
7.本发明还提供一种前述的根瘤菌属细菌或菌剂在植物伤口的修复中的应用。所述植物优选为杨树。
8.具体的，所述应用为在伤口处施用由菌株11760制备的菌剂；
9.施用方法为喷施或涂抹；
10.施用浓度为菌株11760活性菌数量≥108cfu/ml；
11.施用后可将伤口部位用保鲜膜等薄膜材料包裹保湿；
12.施用时期优选为伤口发生后1-2小时内。
13.本发明的有益效果包括：
14.本发明从杨树树皮中分离得到的杨树内生细菌中，意外发现一株根瘤菌rhizobium sp.菌株11760能够促进杨树伤口愈合。采用本发明的根瘤菌属细菌11760菌株制备的菌剂能够有效促进杨树伤口快速愈合，对植物伤口具有较好的促进愈合效果，通过田间伤口愈合治疗试验发现，在植物伤口形成初期施加本发明的菌剂能够明显的促进伤口快速愈合，比对照早愈合10天以上，适合在植物伤口管理实践中推广应用。
附图说明
15.图1为本发明实施例2中接种试验第3天的树皮愈合图，其中，图1a为阴性对照；图
1b施用细菌伤口愈合菌剂11760。
具体实施方式
16.下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
17.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
18.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
19.实施例1、菌株的筛选与鉴定
20.(1)伤口愈合菌株的获得与鉴定
21.取杨树树皮，用研钵研细，加入无菌水稀释后涂板，置于30℃培养箱中倒置培养24h后挑取单菌落，在新培养皿上划线培养。
22.在杨树病原菌田间回接实验中需要将单独培养的菌落接种到树体的伤口处测定该菌的致病性，实验过程中意外发现在植物伤口处接种菌株11760时，接种处植物伤口愈合的速度较接种其他菌株和对照实验的均更快。
23.(2)细菌鉴定
24.ctab法提取菌株的dna，利用细菌的通用引物27f/1492r(5'-agagntgatcctggctcag-3'/5'-ggttaccttgttacgactt-3')进行pcr扩增，pcr产物送北京博迈德基因技术有限公司测序。然后利用网络鉴定工具(https://eztaxon-e.ezbiocloud.net/identify)对本发明菌株进行鉴定，将其16s rrna基因序列信息输入数据库进行比对，本发明菌株11760与模式菌株rhizobium alkalisoli ccbau 01393
t
同源性为98.5％。
25.根据分子鉴定结果，将本发明的菌株11760鉴定为根瘤菌rhizobium sp.，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间为2018年02月08日；保藏编号为：cgmcc no.15351。
26.实施例2、田间伤口愈合试验
27.(1)菌剂的制备
28.将保藏的菌株备份划线培养，然后挑取单菌落再连续转接培养3代。挑取单菌落转接到150ml tsb液体培养基中进行扩繁培养，30℃培养条件下，220rpm振荡培养24h。然后10000rpm离心5min沉淀培养的菌株，将沉淀用无菌水稀释成数量为108cfu/ml左右的菌液。
29.(2)田间实验
30.无菌脱脂棉用无菌水浸泡，以备接种使用。
31.田间实验在濮阳市林科院苗圃和中国林业科学研究院温室开展，试验树种为杨树，在苗圃中随机选取5株树苗开展伤口愈合实验。
32.用无菌手术刀在树皮上制造相同大小的伤口作为接种点，伤口深至木质部表层；接种后覆上浸过无菌水的脱脂棉，并用保鲜膜包裹保湿；每棵树接种2个点,从上而下分别为：
33.接种点1：接种无菌水(阴性对照)；
34.接种点2：接种11760菌剂；
35.具体的接种方法包括：阴性对照组是在人造伤口上接种100ul无菌水后覆盖浸水脱脂棉保湿，然后包裹保鲜膜；接种11760菌剂实验组是在人造伤口处接种100ul的108cfu/ml的步骤(1)中制备的11760菌剂后覆盖浸水脱脂棉保湿，然后包裹保鲜膜。
36.接种后第3、8、13天时，观察记录的伤口愈合情况，如图1所示，接种后第3天时，施用本发明的菌剂的伤口已经愈合，而阴性对照伤口边缘开始发黑,并无愈合迹象，至到第13天的时阴性对照才逐渐长出愈伤组织。说明本菌剂对杨树的愈合伤口具有很好的促进的效果，可以广泛应用于杨树移栽、修剪以及其它田间操作过程中造成大量伤口的修复。


技术特征：
1.一种根瘤菌(rhizobium sp.)，其特征在于，所述根瘤菌菌株命名为根瘤菌11760，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间为2018年02月08日；保藏编号为：cgmcc no.15351。2.一种细菌菌剂，其特征在于，所述菌剂由权利要求1所述的根瘤菌菌株11760制备而成。3.根据权利要求2所述的细菌菌剂，其特征在于，所述菌剂中菌株11760活性菌数量≥108cfu/ml。4.权利要求1所述的根瘤菌或权利要求2-3任一项所述的菌剂在植物伤口的修复中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为在伤口处施用由菌株11760制备的菌剂。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，施用方法为喷施或涂抹。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌剂浓度为菌株11760活性菌数量≥108cfu/ml。8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，施用后将伤口部位包裹保湿。9.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，施用时期为伤口发生后1-2小时内。

技术总结
本发明公开了一种根瘤菌(Rhizobium sp.)、由其制备的菌剂及其应用。采用本发明的根瘤菌菌株11760制备的菌剂能够有效促进杨树伤口快速愈合，对植物伤口具有较好的促进愈合效果，通过田间治疗试验发现，在杨树伤口形成初期施加本发明的菌剂能够明显的促进伤口的快速愈合，适合在植物伤口管理实践中推广应用。用。用。


技术研发人员：李永 薛寒 姜宁 朴春根 汪来发
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所
技术研发日：2021.11.18
技术公布日：2022/2/15