前列腺癌诊断用尿液mirna标志物、诊断试剂及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种前列腺癌诊断用尿液mirna标志物、诊断试剂及试剂盒。


背景技术：

2.根据国家癌症中心的数据，前列腺癌自2008年起成为男性泌尿系统中发病率最高的肿瘤，2014年的发病率达到9.8/10万，在男性恶性肿瘤发病率排名中排第6位；死亡率达到4.22/10万，前列腺癌(pca)是中国男性癌症相关死亡的十大主要原因之一。而且我国前列腺癌呈现逐年递增的趋势，值得注意的是我国前列腺癌发病率在城乡之间存在较大差异，特别是大城市的发病率更高。世界范围内，前列腺癌发病率在美国排名第二，在欧洲排名第三。
3.虽然前列腺癌是发病率较高的疾病，但目前对其发病的原因了解较少。已建立的风险因素仅限于年龄，恶性肿瘤的家族史，以及某些基因突变(例如，brca1和brca2)和发生条件(林奇综合征)。同时，其发病率与种族也有一定相关性，不同种族中，黑人男子发病率最高。另外，目前比较确定的风险因素还包括生活方式和环境因素，如吸烟，体重超重和营养因素都可能增加晚期前列腺癌风险通常。
4.pca是一种生长缓慢的肿瘤，多达40％的确诊男性根本没有任何临床症状。然而，如果在早期(即局部)诊断出pca，患者的五年生存率大于99％，但如果在晚期、高级别转移阶段被诊断出，患者的生存率只有约30％.因此，早期诊断性pca筛查有可能从根本上减少这种癌症的医疗保健负担。
5.前列腺特异性抗原(psa)是一种34kda,由237个氨基酸组成的单链糖蛋白,几乎只由前列腺上皮细胞产生。2018年美国预防医学工作组发布的申明中不建议70岁以上人群进行psa方法筛查，对于55-69岁人群，是否定期进行psa方法筛查则需要视个人情况而定。长期以来，psa为基础的前列腺癌筛查被广泛应用，但psa方法结果假阳性比例高，易造成过度诊断和过度治疗。
6.前列腺穿刺活检是筛查和诊断前列腺癌的金标准测试。然而，经直肠或经会阴前列腺系统穿刺活检术的主要局限在于假阴性、漏诊高危前列腺癌和过度诊断。如何在提高穿刺阳性率的同时避免过度诊断是前列腺癌早期诊断中面临的巨大挑战。因此，开发更安全、高效、特异的前列腺癌和/或高危前列腺癌检测方式是非常迫切的。
7.多项研究表明，尿液中含有许多不同种类的rna，包括mrna、微小rna(mirna)和其他非编码蛋白(nc)rna。由于与血液相比更易于检测，尿液是用于泌尿系统癌症筛查的特别有吸引力的生物标志物来源，并且可以在较早阶段捕获疾病。
8.mirna是长度为18-25个核苷酸的短非编码rna，可以通过特定目标mrna的分解或通过抑制其翻译来阻止蛋白质表达，参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着类似于致癌基因或抑癌基因的功能。mirna的表达谱具有明显的组织特异性，在不同肿瘤中具有特定的表达模式。这些特点都使得mirna有可能
成为肿瘤诊断新的生物学标记和治疗靶标。有研究表明mirna可以在尿液中以游离形式存在，近来许多研究证明患者尿液中的mirna可作为早期泌尿系统癌症诊断的生物标志物。
9.尽管现有的研究报道了一些泌尿系统癌证早期诊断用的mirna标志物，但这些标志物或多或少都有检测的局限性，最终能用于前列腺癌筛查的尿液mirna生物标志物以及生物标志物组合标志物还未见定论，急需开发新的适合于前列腺癌诊断用尿液mirna标志物。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种前列腺癌诊断用尿液mirna标志物、诊断试剂及试剂盒，相对国际上报道的其它mirna标志物，具备有更高的人群特异性；所公开的mirna诊断标志物均为首次提出，相较于其他mirna分子标志物更可靠。为前列腺癌诊断提供了一种新的可选途径。
11.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种前列腺癌诊断用尿液mirna标志物，所述尿液mirna标志物选自以下方案之一：
①
hsa-mir-375、hsa-mir-520d-5p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-518e-5p、hsa-mir-31-3p、hsa-mir-4306中任意一种；
②
hsa-mir-375、hsa-mir-520d-5p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-518e-5p、hsa-mir-31-3p、hsa-mir-4306中两种及两种以上组合；
③
hsa-mir-375与hsa-mir-520d-5p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-518e-5p、hsa-mir-31-3p、hsa-mir-4306中任意一种或多种的组合。
12.作为最优选的组合方式，所述尿液mirna标志物为hsa-mir-375、hsa-mir-520d-5p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-518e-5p、hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306的组合。
13.一种前列腺癌诊断试剂，所述前列腺癌诊断试剂包括权利要求1所述尿液mirna标志物。
14.一种前列腺癌诊断用试剂盒，所述前列腺癌诊断用试剂盒包括权利要求1所述尿液mirna标志物作为标准品，以及检测权利要求1所述尿液mirna标志物的相应引物。
15.本发明的有益效果是：本发明明确hsa-mir-375单独和包含hsa-mir-375在内的6个适用于中国人群前列腺癌的两种特异性诊断标志物组合。上述mirna诊断标志物均为首次提出，相较于其他mirna分子标志物更可靠。
16.与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：(1)本发明首次发现了hsa-mir-375、hsa-mir-520d-5p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-518e-5p、hsa-mir-31-3p、hsa-mir-4306可作为新的前列腺癌标志物组合，上述标志物组合在前列腺癌的早期检测和诊断中有重要的价值；(2)本发明的mirna标志物检测，操作简便，可行性强，灵敏度和特异性高，具有临床诊断和指导意义。
17.(3)本发明可通过尿液检测mirna表达量，从而达到无创的目的。
附图说明
18.图1为10个有差异表达(p《0.05)的前列腺癌mirna诊断标志物的表达水平热图。mirna的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。点的颜色表示浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(mirna和样品)进行分层聚类。对于水平维度，使用颜色表示病例-对照的受试者。
19.图2为前列腺癌mirna诊断标志物组合在各队列的auc图；其中，图2-a为10个前列腺癌mirna诊断标志物组合在各队列的auc图，图2-b为6个前列腺癌mirna诊断标志物组合在各队列的auc图。
20.图3为6个前列腺癌mirna诊断标志物组合在对照和癌症预测值的线箱图。
具体实施方式
21.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
22.本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
23.针对前列腺癌检测方法包括以下步骤：a)测定人类来源的被检测样本和参考样本中hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p，hsa-mir-4306的表达水平；b)比较被检测样本中与参考样本中hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p，hsa-mir-4306的表达水平；其中，被检测样本中上述mirna的任一种的表达水平与参考样本中相应mirna的表达水平相比出现显著变化，表明该个体可能患有前列腺癌。
24.具体来讲，被检测前列腺癌中任意一种mirna的表达水平比参考样本中mirna的表达水平发生显著变化时，样本提供者可能患有前列腺癌。在较佳的实施方案中，被检测尿液样本中任意10种mirna的表达水平比参考样本中mirna的表达水平发生显著变化时，样本提供者可能患有前列腺癌。在更佳的实施方案中，被检测尿液样本中6种mirna的表达水平比参考样本中mirna的表达水平发生显著变化时，样本提供者可能患有前列腺癌。
25.本发明中，参考样本来自健康人源尿液样本。
26.另一方面，本发明提供了一种检测前列腺癌microrna的方法。具体地说，该方法包括逆转录和实时荧光定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)。更具体地，在实时荧光定量聚合酶链式反应中，使用的引物组合为hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p，hsa-mir-4306检测的逆转录引物和pcr引物组合。
27.可以根据相关mirna的序列，对本发明的引物序列做出适当调整和修改，这些经过修改的引物序列仍可以用于检测所述mirna标志物。本发明也包括这些等同的技术方案。
28.本发明使用rt-qpcr方法，相较于基于数百个分子的芯片，具备更可靠的临床可行性和实用性，而且成本低，更易于推广。另外，对于上述mirna的检测方法，不限于本发明提供的rt-qpcr法，其他方法例如测序法，微阵列，rna印迹，生物发光和探针法等也可用于检测所述的mirna标志物。
29.申请人在研究中发现任意一种可以用于诊断前列腺癌的mirna标志物，任意2种-5种也可以用于诊断前列腺癌的mirna标志物组合，利用上述标志物，前列腺癌可以被可靠地鉴定。
30.本发明公开了hsa-mir-375单个诊断标志物；以及hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306在内的前列腺癌诊断标志物组合，hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306，有多重核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个mirna序列。具体序列信息如下表1所示。
31.本发明公开的所有mirna序列均已经储存在mirbase数据库中(http://www.mirbase.org/)。
32.表1表1
33.本发明公开了2种前列腺癌诊断标志物，包括单个hsa-mir-375核酸分子；以及hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306多个核酸分子。编码hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306的任何一个或任何两个或任何三个或任何四个或任何五个或任何六个核酸分子在诊断为前列腺癌患者的尿液中的表达比对对照中的表达相比发生显著变化。在前列腺癌诊断最优的实施方案中，所述的多个核酸分子包hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306的6个核酸分子组合。
34.实施例1：验证队列验证用于前列腺癌诊断的10个mirna组合一：前列腺癌诊断标志物组合研发队列尿液样本要求，采集和抽提前列腺癌诊断标志物研究中使用了2组样本，分别为病例组合对照组，病例组包含83例前列腺癌样本，对照组为88例健康人尿液样本，发现和验证了用于检测早期前列腺癌的生物标记物和生物标记物组合。研发队列中的前列腺癌病例和健康样本均来浙江大学医学院附属第二医院。
35.二：逆转录-实时荧光pcr操作过程及结果按照zymo血清血浆cfdna快速抽提试剂盒操作步骤进行抽提，抽提完成后，利用
mirxe反转录试剂盒操作步骤进行反转录，反转录完成后qpcr扩增进行质检。
36.质检完成后进行样本qpcr扩增，检测312个mirna的表达量，癌症和健康对照中全部312个mirna的表达没有存在明显的分级，进一步研究发现了用于前列腺检测的单个mirna生物标记物，校正之后发现10个mirnas的p值小于0.05，其中在前列腺癌受试者中上调了5个，下调了5个。在研发队列中提取这10个mirna绘制heatmap热图，观察到癌症和对照受试者之间存在mirna表达量的显著差异，如图1所示。
37.三：验证队列验证上述10个mirna病例-对照队列采用交叉验证(leave-one-out cross-validation)的方法检测这10种尿液mirna生物标志物。验证队列样本为171个样本，诊断效能auc＝0.738，如图2-a所示。
38.实施例2：验证队列验证用于前列腺癌诊断的最优6个mirna组合研发队列尿液样本要求，采集和抽提，逆转录-实时荧光pcr操作过程及结果和实施例1中描述相同，基于前面筛选出的10个mirna，分别使用lasso、stepwise以及穷举法等算法进行mirna组合的优化，最终确定了最优的6个mirna组合，又使用交叉验证(leave-one-out cross-validation)的方法验证hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306这6种尿液生物标志物组合(最优组合)。验证队列样本为171个样本，6个mirna组合在验证队列中的诊断效能auc＝0.75，如图2-b所示。模型判读的结果如图3所示，可以看到癌症患者的模型输出概率显著高于对照受试者，说明模型可以较好地对癌症患者和对照受试者进行预测分类。
39.基于上述对比确认6个mirna组合为诊断前列腺癌的最优组合。
40.本发明建立了一个完整的工作流程，用于发现和验证尿液mirna生物标志物组合，及成功确定了用于检测前列腺癌的生物标志物及生物标志物组合。
41.编码hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306的任何一个或任何两个或任何三个或任何四个或任何五个或任何六个核酸分子在诊断为前列腺癌患者的尿液中的表达比对对照中的表达相比发生显著变化。
42.在最优的实施方案中，所述的多个核酸分子包hsa-mir-375，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-518e-5p，hsa-mir-31-3p和hsa-mir-4306的6个核酸分子组合。
43.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。