1.本发明涉及纳米铂制备技术领域，尤其涉及的是一种利用青蒿提取物合成纳米铂的方法及应用。


背景技术：

2.近年来，纳米技术因其在化妆品工业和药物输送方面的巨大优势而受到广泛关注。纳米技术是指在纳米尺度(1至100纳米)上进行的科学技术，近40年，纳米技术方法也在不断进入化妆品和其他健康产品领域。迄今为止，已经开发了用于皮肤和透皮给药的各种纳米颗粒给药系统，大多数研究表明纳米颗粒(np)增强了药物进入和穿过皮肤的渗透能力，并提高了药物的活性和耐受性。皮肤衰老不仅影响容颜，还和很多皮肤疾病相关，因此预防和延缓皮肤衰老受到广泛关注。
3.纳米铂具有非常好的抗氧化性能，在对抗皮肤衰老方面发挥了关键作用。目前纳米铂的合成大多数都是基于物理和化学方法，其中用到的还原剂和稳定剂都易污染环境。
4.如中国专利申请号为：cn202110366271.9，公开“一种燃料电池氧还原电化学反应所用的以碳纳米管为载体的纳米铂催化剂及其制备方法”。
5.上述专利公开的技术方案中公开了如下制备方法：
6.碳纳米管载体其特征表面覆盖有一层原位生长的氧化锰亲水功能层，铂纳米颗粒则均一分散在该氧化锰亲水层上，并与其形成复合晶相。其制备方法的特征为利用碳纳米管表面覆盖的氧化锰功能层，使液相中铂离子与较低价态的锰发生置换反应，从而使得纳米铂原子层均一沉积到氧化锰上成型。该制备方法工序简单，合成的催化剂氧还原性能高，具有很好的产业化应用前景。
7.利用生物资源合成纳米铂比其他两种方法更有优势。生物合成法具有成本低，对生态友好，易于大规模合成等特点，更适合应用于美容保健领域。
8.青蒿，被誉为“中国神草”，具有抗病毒、消炎、解热、镇咳平喘、降血压、保肝利胆等作用。利用青蒿提取物还原纳米铂，能被应用到更广泛的护肤领域。


技术实现要素：

9.本发明所要解决的技术问题在于提供了一种利用青蒿提取物合成纳米铂的方法。
10.本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
11.一种利用青蒿提取物合成纳米铂的方法，包括以下步骤：
12.(1)取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:1-1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，0-100℃超声0.5-6h，-20℃放置24小时；
13.(2)离心机8000-15000r/min离心10-30min，取上清，干燥，得到青蒿提取物干粉；
14.(3)称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按1：100-10：100溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液；
15.(4)取提取液1-4ml加入氯铂酸0.001-0.1mol,剧烈搅拌30min-3小时，反应混合物
从黄色变为黑色，形成纳米铂；
16.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，8000-15000r/min离心10-30min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
17.优选地，所述步骤(1)中，取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:10的比例与超纯水混匀，得到混合液，0℃超声30min；
18.步骤(2)中，离心机8000r/min离心10min，取上清，干燥，得到青蒿提取物干粉；
19.步骤(3)中，称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按1：100溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液；
20.步骤(4)中，取提取液1ml加入氯铂酸0.001mol,剧烈搅拌30min，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
21.步骤(5)中，将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
22.优选地，所述步骤(1)中，取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:20的比例与超纯水混匀，得到混合液，30℃超声2个小时；
23.(2)离心机10000r/min离心15min，取上清，干燥，得到青蒿提取物干粉；
24.(3)称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按2：100溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液；
25.(4)取提取液2ml加入氯铂酸0.01mol,剧烈搅拌1小时，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
26.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
27.优选地，所述步骤(1)中，取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:50的比例与超纯水混匀，得到混合液，60℃超声4个小时；
28.所述步骤(2)中，离心机12000r/min离心20min，取上清，干燥，得到青蒿提取物干粉；
29.所述步骤(3)中，称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按5：100溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液；
30.所述步骤(4)中，取提取液3ml加入氯铂酸0.05mol,剧烈搅拌2小时，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
31.所述步骤(5)中，将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
32.优选地，所述步骤(1)中，取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6个小时；
33.所述步骤(2)中，离心机15000r/min离心30min，取上清，干燥，得到青蒿提取物干粉；
34.所述步骤(3)中，称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按10：100(溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液；
35.所述步骤(4)中，取提取液4ml加入氯铂酸0.1mol,剧烈搅拌3小时，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
36.所述步骤(5)中，将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20min，沉淀用纯
水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
37.优选地，所述步骤(2)中干燥的方式为冻干干燥。
38.优选地，所述步骤(3)中青蒿提取物与水之间的比例为质量与体积之比。
39.本发明同时公开上述利用青蒿提取物合成纳米铂的方法合成的纳米铂在制备化妆品中的应用。
40.优选地，所述化妆品为面膜、精华液、面霜、眼霜或爽肤水中的任意一种。
41.本发明相比现有技术具有以下优点：
42.本发明公开一种利用青蒿提取物合成纳米铂的方法，具有以下有益效果：
43.1、本发明所采用的合成纳米铂的方法，次生代谢产物含量高，无二次污染，节约成本，简化了生产步骤。
44.2、本发明所采用的合成方法，合成的纳米粒子稳定，青蒿提取物所含有的多酚和黄酮等物质能与纳米粒子表面结合，防止聚集。
45.3、本发明提供的青蒿纳米铂，生物活性高，具有显著地抗氧化和抗衰老作用。
46.4、本发明提供的纳米铂溶液能够清除dpph自由基，具有抗衰老能力，可以促进胶原蛋白合成，适合应用在化妆品中。
附图说明
47.图1为发明实施例制得的纳米铂紫外吸收光谱图；
48.图2为发明实施例制得的纳米铂离子透射电镜图；
49.图3为发明实施例的纳米铂对dpph自由基的清除作用柱形图；
50.图4为发明实施例制得的纳米铂对hff-1细胞的毒性图；
51.图5为发明实施例制得的纳米铂对hff-1细胞i型胶原蛋白分泌的影响图；
52.图6为发明实施例制得的纳米铂对a375细胞的毒性分析图；
53.图7为发明实施例制得的纳米铂对a375细胞中酪氨酸酶的抑制作用图。
具体实施方式
54.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
55.实施例1
56.(1)取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:10的比例与超纯水混匀，得到混合液，0℃超声30分钟；
57.(2)离心机8000转离心10分钟，取上清，冻干，得到青蒿提取物干粉；
58.(3)称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按1：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液。
59.(4)取提取液1ml加入氯铂酸0.001mol,剧烈搅拌30分钟，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
60.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
61.实施例2
62.(1)取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:20的比例与超纯水混匀，得到混合液，30℃超声2个小时；
63.(2)离心机10000转离心15分钟，取上清，冻干，得到青蒿提取物干粉；
64.(3)称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按2：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液。
65.(4)取提取液2ml加入氯铂酸0.01mol,剧烈搅拌1小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
66.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
67.实施例3
68.(1)取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:50的比例与超纯水混匀，得到混合液，60℃超声4个小时；
69.(2)离心机12000转离心20分钟，取上清，冻干，得到青蒿提取物干粉；
70.(3)称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按5：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液；
71.(4)取提取液3ml加入氯铂酸0.05mol,剧烈搅拌2小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
72.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
73.实施例4
74.(1)取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6个小时；
75.(2)离心机15000转离心30分钟，取上清，冻干，得到青蒿提取物干粉；
76.(3)称取步骤(2)得到的青蒿提取物，按10：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到青蒿提取液。
77.(4)取提取液4ml加入氯铂酸0.1mol,剧烈搅拌3小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
78.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
79.对比例
80.(1)取干燥的青蒿粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6个小时；
81.(2)离心机15000转离心30分钟，取上清，冻干，得到青蒿提取物干粉；
82.(3)将步骤(2)得到的青蒿提取物干粉溶于纯水中，即得对比例溶液。
83.分析实验
84.青蒿还原纳米铂紫外可见光度计分析；
85.在紫外可见光下，氯铂酸在262nm有吸收峰，青蒿提取物在283nm有吸收峰，随着铂被还原，氯铂酸的吸收峰基本消失，同时还可以看到紫外到可见区整个谱带的吸收强度增
加，如图1。
86.青蒿还原纳米铂透射电镜表征；
87.利用透射电子显微镜可以更直接地观察纳米粒子的形貌和大小，将不同实施例制得的纳米铂取出进行表征，由电子衍射图可以看出，实施例制得的纳米粒子尺寸小于10nm，见图2。
88.青蒿纳米铂对dpph自由基的清除作用柱形图；
89.用无水乙醇配置50μg/ml dpph工作溶液，避光保存，向实验组中加入100μl浓度为10mg/l的青蒿纳米铂组合物溶液和900μl的dpph工作液(a1)，向空白组中加入100μl浓度为10mg/l的青蒿纳米铂溶液和900微升的无水乙醇溶液(a2)，向对照组中加入100μl的无水乙醇溶液和900微升dpph工作液(a0)，混匀后，室温黑暗处静置半个小时，离心，去上清在517nm处测定吸光值。实施例1-4的测定结果如表1和图3所示。
90.表1青蒿纳米铂清除dpph自由基的能力
[0091][0092]
从表1和图3中可以看出，青蒿纳米铂实施例四对dpph的清除效率较高，在其浓度为10mg/l时对自由基的清除率为85.4％，清除效果优于实施例1-3和对比例。
[0093]
青蒿还原纳米铂对hff-1细胞的毒性；
[0094]
取对数生长期、浓度为5000个/ml的人hff-1细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl；将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养化。将浓度为0.25mg/l、1mg/l和2.5mg/l的青蒿纳米铂加入到96孔细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育24h；然后向每孔中加入cck8溶液10μl，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育1-4h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。实施例1-4的测定结果如表1所示。
[0095]
表2为青蒿纳米铂对人hff-1细胞存活率(100％)的影响
[0096][0097]
以细胞存活率高于80％为对人hff-1成纤维细胞无毒的标准，从表2和图4中可以看出，实施例3和4中的青蒿纳米铂在浓度不高于1mg/ml时，对hff-1成纤维细胞没有毒性。
[0098]
5、为发明实施例制得的纳米铂对hff-1细胞i型胶原蛋白分泌的影响；
[0099]
取对数生长期、浓度为5000个/ml的人hff-1细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl；向实验组中分别加入10μl浓度为0.25mg/l、1mg/l、2.5mg/l的青蒿纳米铂，空白组中不加样品，分别于37℃孵育24h；收集细胞培养上清液，采用elisa法，用酶标仪在450nm处测定吸光值，计算出i型胶原蛋白的相对含量。实施例1-4的测定结果如表3和图5所示。
[0100]
表3青蒿纳米铂对hff-1细胞i型胶原蛋白分泌的影响
[0101][0102]
由表3和图5可知，向hff-1细胞中添加本发明提供的浓度为1mg/l的青蒿纳米铂后，实施例四中，皮肤中的i型胶原蛋白含量为135％，说明本发明实施例4提供的青蒿提取物能够显著的促进i型胶原蛋白的表达，可以作为抗老因子添加到化妆品中。
[0103]
青蒿还原纳米铂对a375细胞的毒性分析；
[0104]
取对数生长期、浓度为3000个/ml的人a375细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl，每个样品设3个复孔；将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养化。将浓度为0.1mg/l、1mg/ml和10mg/ml的青蒿纳米铂加入到96孔细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育24h；然后向每孔中加入cck8溶液10μl，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育1-4h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。实施例1-4的测定结果如表4和图6所示。
[0105]
表4为青蒿纳米铂对人a375细胞存活率(100％)的影响
[0106][0107]
以细胞存活率高于80％为对人a375黑色素瘤细胞无毒的标准，从表4和图6中可以看出，实施例1-4中的青蒿纳米铂在浓度不高于1mg/ml时，对a375黑色素瘤细胞没有毒性。
[0108]
7、为发明实施例制得的纳米铂对a375细胞中酪氨酸酶的抑制效果；
[0109]
取对数生长期、浓度为106个/ml的人a375细胞，取细胞200μl接种于有1ml培养液的35mm的细胞培养皿中，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中贴壁培养化；向实验组中分别加入10μl浓度为0.1mg/l、0.5mg/l、1mg/l的青蒿纳米铂，空白组中不加样品，分别于37℃孵育24h；吸弃细胞培养液，用pbs清洗2次，加入含有pmsf的1％的troton-x-100细胞裂解液100μl，迅速置于-20℃冷冻30分钟，4℃融化后收集样品，并于4℃离心15分钟，转速为12000rpm每分钟。收集上清，bca定量后，再加入4mg/ml的左旋多巴溶液100微升，37℃水浴3h,用酶标仪在490nm处测定吸光值，计算出酪氨酸酶的抑制效果。
[0110]
实施例1-4的测定结果如表5和图7所示。
[0111]
表5青蒿纳米铂对a375细胞中酪氨酸酶的抑制效果
[0112][0113][0114]
由表5和图7可知，向a375细胞中添加本发明提供的浓度为0.1mg/l的青蒿纳米铂后，实施例2中，对a375细胞中酪氨酸酶的抑制率为67.4％，说明本发明提供的青蒿纳米铂能够显著的抑制酪氨酸酶的表达，可以作为美白因子添加到化妆品中。
[0115]
综上所述，本发明提供的青蒿纳米铂，相对于现有技术制备的纳米铂，具有良好的抗衰老、去除自由基的能力可作为化妆品添加剂加入到化妆品中
[0116]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。