1.本发明涉及一种用于制备富含指甲花醌(lawsone)的散沫花提取物的方法。本发明还涉及一种可通过所述方法获得的散沫花的提取物和包含其的组合物。本发明还涉及一种用于使纤维特别是角蛋白纤维染色的方法。


背景技术：

2.散沫花(lawsonia inermis)通常被称为指甲花(henna)，属于千屈菜科(lythraceae family)。这种灌木可以达到6米高，尤其自然生长于非洲和亚洲的热带和亚热带地区。其具有灰色的树皮，密集的分枝，在最老的枝条上有四边形且带刺的分枝。它的叶子彼此相对生长，并且为单叶和全缘(whole)。有香味的白色或红色花朵聚集成25cm长的大型圆锥花序。
3.指甲花叶子产生红色和橙色色彩，其已被用于使毛发和皮肤染色，或甚至纺织品染色持续超过5000年。
4.它们的染料性质归因于指甲花醌(2-羟基-1,4-萘醌)，其通过迈克尔(michael)加成与皮肤或指甲中的角蛋白发生反应。
[0005][0006]
指甲花醌
[0007]
通常，指甲花醌能够与各种含有氨基的化合物(如蛋白质、肽或氨基酸)进行这种类型的缩合。这就是为什么市售可得的指甲花提取物具有相对低的指甲花醌含量，其还随着时间的推移迅速下降。
[0008]
此外，在散沫花叶子中，以游离状态发现的指甲花醌的量实际上很小。事实上，其主要以糖杂体(heteroside)的形式存在(gallo等人rev.bras.pharmacogn.2014,23,133
–
140；colipa no.c169,2013)。
[0009]
尤其地，已经鉴定了指甲花苷(hennoside)a、b和c，其为单糖基化的指甲花醌衍生物。
[0010]
根据以下所示的反应方案，这些前体水解，然后所得的苷元自氧化，导致指甲花醌的形成。
[0011][0012]
r1＝葡萄糖，r2＝r3＝h；
[0013]
r2＝葡萄糖，r1＝r3＝h；或
[0014]
r3＝葡萄糖，r1＝r2＝h。
[0015]
因此，许多已知的散沫花提取方法包括在酸性介质中的步骤，通常在ph为1至3，在该步骤期间指甲花苷被水解。
[0016]
在文献fr2473310中特别描述了提取方法。


技术实现要素：

[0017]
本发明涉及一种用于制备富含指甲花醌的提取物的方法，其包括以下步骤：
[0018]
a)将散沫花的地上部分在4至8的ph在水中浸渍，使最初存在于散沫花的地上部分中的糖基化的指甲花醌衍生物如指甲花苷被部分或全部酶水解，以提供含有指甲花醌的水溶液(aqueous solution)；
[0019]
b)向在步骤a)中获得的溶液中加入有机溶剂以提供水相(aqueous phase)和有机相，所述有机溶剂选自c
4-c
12
直链或支链醇；
[0020]
c)收集从步骤b)获得的有机相；和
[0021]
d)浓缩从步骤c)收集的有机相，以获得富含指甲花醌的提取物。
[0022]
在权利要求中陈述和/或在下文中描述本发明的其他方面。
[0023]
详细描述
[0024]
本发明的发明人已经开发了一种用于提取散沫花的方法，其能够经由糖基化的指甲花醌衍生物的酶水解获得具有高指甲花醌含量的散沫花提取物。所得的提取物表现出很好的随着时间的推移的稳定性，特别地该稳定性可以比已知的散沫花提取物的稳定性更好。
[0025]
方法
[0026]
本发明涉及一种用于制备富含指甲花醌的提取物的方法，其包括以下步骤：
[0027]
a)将散沫花的地上部分在4至8的ph在水中浸渍，使最初存在于散沫花的地上部分中的糖基化的指甲花醌衍生物如指甲花苷被部分或全部酶水解，以提供含有指甲花醌的水溶液；
[0028]
b)向在步骤a)中获得的溶液中加入有机溶剂以提供水相和有机相，所述有机溶剂选自c
4-c
12
直链或支链醇；
[0029]
c)收集从步骤b)获得的有机相；和
[0030]
d)浓缩从步骤c)收集的有机相，以获得富含指甲花醌的提取物。
[0031]
如本文所使用的表述“富含指甲花醌的提取物”是指一种提取物，其包含相对于干燥提取物的总重量以重量计7％至60％或7％至50％，特别地7％至40％的指甲花醌(在加入任何干燥载体之前-参见下文)。有利地，富含指甲花醌的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计至少7％，优选至少8％，更有利地至少10％的指甲花醌(在加入任何干燥载体之前)。
[0032]
典型地，富含指甲花醌的提取物包含以重量计大于50％或大于60％，有利地大于70％的最初存在于散沫花的地上部分中的指甲花醌，所述指甲花醌在散沫花的地上部分中呈游离形式或糖基化衍生物如指甲花苷的形式。最初存在于散沫花的地上部分中的游离形式和糖基化的指甲花醌衍生物形式的指甲花醌的量也被称为“植物指甲花醌潜力(potential)”。与已知方法相比，本发明的方法能够更多地提取植物指甲花醌潜力。
[0033]
在本发明的方法的一些优选的实施方案中，在步骤d)中获得的富含指甲花醌的提取物包含50％至90％，或60％至90％，特别地70％至90％的植物的指甲花醌潜力。可以根据实施例部分后面的部分描述的hplc测定方法(方法1)来确定植物的指甲花醌潜力。
[0034]
如本文所使用的术语“地上部分”是指植物位于地面以上的部分，例如叶子、叶柄、花、种子和枝条，特别是叶子、枝条和叶柄或其混合物，优选叶子、枝条或其混合物。
[0035]
如本文所使用的术语“糖基化的指甲花醌衍生物”也被称为指甲花醌糖苷(glycoside)或糖杂体，是指以下通式(i)的任何化合物：
[0036][0037]
其中r1、r2和r3彼此独立地表示h或糖，如葡萄糖，r1至r3中的至少一个不为h，
[0038]
糖苷键的水解导致苷元的形成，所述苷元经过自氧化反应以形成指甲花醌。特别地，指甲花苷a、b和c为糖基化的指甲花醌衍生物。
[0039]
如本文所使用的术语“酶水解”为通过酶催化的水解反应，所述酶可以为内源性散沫花酶或来自外部来源的酶，优选内源性散沫花酶，应理解，所述酶为葡萄糖苷酶，如β-葡萄糖苷酶(gallo等人)，其作用导致破坏糖基化的指甲花醌衍生物的葡萄糖苷(glucoside)键。
[0040]
有利地，本发明的方法不包括通过加入酸或碱来改变水溶液或水相的ph的任何步骤。
[0041]
步骤(a)
[0042]
接受浸渍的散沫花的地上部分典型地为叶子、枝条或其混合物。叶子可以为新鲜的或干燥的，优选干燥的。散沫花的地上部分包含糖基化的指甲花醌衍生物。糖基化的指甲花醌衍生物在浸渍步骤期间被酶水解(部分或全部水解)，以提供含有指甲花醌的水溶液。
[0043]
优选在20℃至60℃，或20℃至50℃，特别地25℃至45℃，更特别地30℃至45℃，典型地约40℃的温度进行步骤(a)。
[0044]
在4至8的ph进行步骤(a)。4至8的ph能够使一种或多种催化糖基化的指甲花醌衍生物水解的酶起作用。在一些实施方案中，在5至7.5，有利地5.5至7.5，典型地中性ph的ph进行步骤a)。“中性ph”是指6.5至7.5，特别是约7的ph。
[0045]
典型地，在搅拌下进行步骤(a)。可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来进行搅拌。
[0046]
典型地，将散沫花的地上部分浸渍持续15分钟至2小时，优选15分钟至1小时，有利地约30分钟。
[0047]
在一些实施方案中，在搅拌下进行步骤(a)15分钟至2小时，优选15分钟至1小时，有利地约30分钟。
[0048]
典型地，散沫花的地上部分浸渍在一定体积的水中，所述水的重量比散沫花的地上部分的重量大2至15倍，有利地大5至15倍，更有利地大6至10倍，典型地大10倍。例如，当根据本发明的方法在100g的散沫花的地上部分中实施时，在步骤a)中使用的水的体积可以
为200ml至1500ml，或500ml至1500ml，有利地600ml至1000ml，典型地1000ml。
[0049]
步骤(b)
[0050]
将有机溶剂加入到在步骤a)中获得的水溶液中。
[0051]
在一些实施方案中，将有机溶剂直接加入到在步骤a)中获得的水溶液中。然后，水溶液包含植物材料和浸渍水。在这些实施方案中，应理解，将有机溶剂直接加入到在步骤a)中获得的水溶液中，即，在步骤a)和b)之间不进行过滤步骤。
[0052]
在一些实施方案中，方法包括在步骤a)和步骤b)之间的过滤步骤，以从含有指甲花醌的水溶液中分离散沫花的地上部分。可替代地，在一些实施方案中，方法包括在步骤c)和步骤d)之间的过滤步骤，以从在步骤c)中回收/收集的有机相中分离散沫花的地上部分。
[0053]
加入至水溶液中的有机溶剂选自c
4-c
12
直链或支链醇及其任何混合物。
[0054]
如本文所使用的术语“醇”是指式r
4-oh的化合物，其中r4为c
4-c
12
烃链。
[0055]
如本文所使用的术语“c
4-c
12
烃链”表示包含4至12个碳原子，优选4至8个碳原子的直链或支链的、饱和或不饱和的(优选饱和的)烃链。“c
4-c
12
烃链”的示例包括但不限于丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基，包括它们的任何位置异构体。
[0056]
在一些实施方案中，有机溶剂为c
4-c8直链或支链醇或其任何混合物。
[0057]
有机溶剂优选选自正丁醇、仲丁醇、异丁醇及其任何混合物。更优选地，有机溶剂为正丁醇。
[0058]
为了提供更绿色且能够宣称所得的提取物是天然的方法，本发明中使用的溶剂优选为天然溶剂和/或天然来源的溶剂，即，获得自可再生资源(而非化石资源)。这些溶剂可有利地通过尊重环境的方法获得。因此，在一些实施方案中，有机溶剂为生物来源的溶剂，更具体地生物来源的c
4-c
12
直链醇或生物来源的c
4-c
12
支链醇。在这些实施方案中，根据本发明的方法获得的提取物可以有资格作为天然提取物和/或天然来源的提取物，即，来自于可再生资源而非化石资源。
[0059]
在本发明中使用醇具有许多优点，特别是在工业水平的溶剂回收过程中。与酯(例如乙酸乙酯或乙酸异丙酯)或某些酮(特别是丙酮)不同，醇在回收操作期间不会降解。此外，溶剂中残留水的存在不会造成任何回收实施问题。醇使得回收便利化。
[0060]
可以分批地或连续地进行步骤b)。
[0061]
在一些特别的分批实施方案中，根据本发明的方法的步骤b)包括以下3个子步骤：
[0062]
b.1)向在步骤a)中获得的水溶液中加入有机溶剂，所述有机溶剂为c
4-c
12
直链醇、c
4-c
12
支链醇或其混合物；
[0063]
b.2)搅拌在步骤b.1)中获得的溶液持续15分钟至2小时，特别地15分钟至1小时，典型地约30分钟；和
[0064]
b.3)倾析在b.2)中获得的混合物，直到获得两个不同的相，即，水相和有机相。
[0065]
因此，连续的子步骤b.1)、b.2)和b.3)导致水相和有机相的形成。
[0066]
在步骤b)期间，特别是在步骤b.1)期间加入的有机溶剂的体积使得在b)期间加入的所述有机溶剂与在步骤a)期间使用的水的体积的体积比为0.25至2，尤其0.5至2，尤其0.8至1.5，特别地1至1.3。
[0067]
步骤c)和d)和另外的任选步骤
[0068]
收集在进行步骤b)之后获得的有机相，然后浓缩。
[0069]
典型地，丢弃在进行步骤b)之后获得的水相。然而，容易理解的是，步骤b)可以重复至少一次。因此，在第二次步骤b)中，可以将如本文所公开的有机溶剂加入到在进行第一次步骤b)之后收集的水相中。收集在进行第二次步骤b)之后得到的有机相，并与在进行第一次步骤b)之后得到的有机相合并。然后将合并的有机相浓缩。
[0070]
在一些实施方案中，根据本发明的方法包括步骤b)的多次重复，例如2至5次重复，然后进行步骤c)。然后，方法包括浓缩在步骤c)之前的步骤b)的多次重复中回收的有机相的组合的步骤作为步骤d)。
[0071]
有利地，在步骤d)中获得的富含指甲花醌的提取物包含大于50％或大于60％，有利地大于70％的最初存在于散沫花的地上部分中的指甲花醌，所述指甲花醌在散沫花的地上部分中呈游离形式或糖基化衍生物如指甲花苷的形式。
[0072]
有利地，在步骤d)中获得的富含指甲花醌的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计7至60％的指甲花醌，并进一步包含木犀草素(luteolin)、芹菜素(apigenin)和2,3,4,6-四羟基苯乙酮。
[0073]
有利地，在步骤d)中获得的富含指甲花醌的提取物进一步包含香豆酸和/或糖基化的木犀草素，特别是木犀草素-6-c-新橙皮苷。
[0074]
有利地，在步骤d)中获得的富含指甲花醌的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计不大于2％的蛋白质、肽或氨基酸。
[0075]
在一些实施方案中，根据本发明的方法进一步包含干燥在步骤d)中获得的富含指甲花醌的提取物的步骤(步骤e))。因此，获得干燥的富含指甲花醌的提取物。可以根据本领域技术人员熟知的方法进行干燥。特别地，可以通过托盘干燥机、真空干燥、雾化、微波、沸石干燥(zeodration)或冻干来进行干燥步骤。
[0076]
如本发明所使用的术语“干燥提取物”是指没有提取溶剂或介质的提取物，或仅含有不显著的痕量的提取溶剂或介质的提取物。因此，这种干燥提取物仅含有来自于散沫花的物质。
[0077]
有利地，在步骤e)中获得的干燥的富含指甲花醌的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计0.6至1.4％的指甲花醌，并进一步包含木犀草素、芹菜素和2,3,4,6-四羟基苯乙酮。
[0078]
有利地，在步骤e)中获得的干燥的富含指甲花醌的提取物进一步包含相对于干燥提取物的总重量：
[0079]-以重量计0.05至1.0％的木犀草素，
[0080]-以重量计0.01至0.5％的芹菜素，和
[0081]-以重量计0.05至1.0％的2,3,4,6-四羟基苯乙酮。
[0082]
在一些实施方案中，根据本发明的方法进一步包括在步骤c)和d)之间的加入载体(如下文所定义)的步骤c’)，和步骤d)之后的干燥步骤e)。可以如上文所公开进行步骤e)。因此，获得标准化的干燥的富含指甲花醌的提取物。
[0083]
在一些实施方案中，根据本发明的方法进一步包括提取颜料的步骤，也被称为脱色步骤。在脱色步骤期间提取的颜料尤其为叶绿素。应理解，指甲花醌不是脱色步骤试图去除的颜料的一部分。
[0084]
可以用有机溶剂提取颜料。容易理解，有机溶剂为不能很好地溶解指甲花醌的溶
剂。因此，在25℃，指甲花醌在用于脱色步骤的有机溶剂中的溶解度以重量计小于15％，尤其小于10％，有利地小于5％；以相对于接受脱色步骤的提取物或溶液中所含有的指甲花醌的总重量表示百分比。优选地，在脱色步骤中使用指甲花醌不溶于其中的有机溶剂。有利地，所述有机溶剂为饱和烃或不饱和烃。术语“饱和烃或不饱和烃”是指仅由氢和碳原子组成的化合物。在一些实施方案中，饱和烃选自戊烷、己烷、庚烷、壬烷、癸烷和环己烷。在一些实施方案中，不饱和烃为苯。
[0085]
优选地，用庚烷作为有机溶剂进行提取颜料(如叶绿素)的脱色步骤。
[0086]
用有机溶剂进行的颜料提取步骤可以包括液-液提取或液-固提取。
[0087]
当颜料提取步骤为液-液提取时，在本发明的方法的步骤a)和b)之间进行所述步骤。
[0088]
有利地，使用有机溶剂的液-液颜料提取步骤包括以下4个子步骤：
[0089]
i)将上面公开的有机溶剂加入到从步骤a)获得的水溶液中，
[0090]
ii)搅拌从步骤i)获得的溶液持续15分钟至2小时，特别地15分钟至1小时，典型地约30分钟，
[0091]
iii)倾析从步骤ii)获得的混合物，直到获得两个不同的相，即，水相和有机相，和
[0092]
iv)去除有机相。
[0093]
然后，在步骤iii)所得的水相中实施本发明的方法的步骤b)。
[0094]
当颜料提取步骤为液-固提取时，液-固颜料提取步骤在本发明的方法的干燥步骤e)之后。可以根据技术人员熟知的方法进行液-固提取。
[0095]
可替代地，可以直接在干燥提取物中使用超临界co2(有或没有加入共溶剂)进行脱色步骤。叶绿素被超临界co2带走(entrain)。残余物为脱色的干燥提取物。
[0096]
在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括过滤步骤，所述过滤步骤位于步骤a)和b)之间以从含有指甲花醌的水溶液中分离散沫花的地上部分，或位于步骤c)和d)之间以从步骤c)中所得的有机相中分离散沫花的地上部分。
[0097]
在一些实施方案中，可以在步骤a)中加入果胶酶型酶(pectinase-type enzyme)。
[0098]
根据本发明的方法还可以应用于含有指甲花醌的任何其他植物，如凤仙花(impatiens balsamina)。技术人员将知晓如何使本发明的方法适应所讨论的植物。因此，在凤仙花的情况下，技术人员将进行根(凤仙花中最富含指甲花醌的部分)的提取。
[0099]
散沫花提取物
[0100]
如本文所公开的发明能够制备具有高指甲花醌含量的散沫花的地上部分的提取物，特别是散沫花的叶子和/或枝条的提取物。所述提取物的指甲花醌含量随着时间的推移是稳定的。
[0101]
在一个方面，本发明涉及一种散沫花的地上部分的提取物，特别是散沫花的叶子和/或枝条的提取物，其包含相对于干燥提取物的总重量以重量计7至60％的指甲花醌，其中指甲花醌来源于糖基化的指甲花醌衍生物如指甲花苷的酶水解，并且其中提取物的指甲花醌含量随着时间的推移在所述提取物中是稳定的。
[0102]
在第二方面，本发明还涉及一种可以通过本文公开的方法获得的散沫花的地上部分的提取物，特别是散沫花的叶子和/或枝条的提取物。提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计7至60％的指甲花醌，其中指甲花醌来源于糖基化的指甲花醌衍生物如指甲
花苷的酶水解，并且其中提取物的指甲花醌含量随着时间的推移是稳定的。
[0103]
根据本发明的第一或第二方面的散沫花的地上部分的提取物如下文所描述。
[0104]
如果在室温(15℃-25℃)，相对湿度(rh)为60％且避光的情况下，最初存在于提取物中的指甲花醌的量在1个月内降低不大于50％，有利地不大于40％，特别地不大于30％，有利地不大于20％，尤其不大于15％，有利地不大于10％，则如本文所公开的提取物的指甲花醌含量被认为是“随着时间的推移是稳定的”。室温值为欧洲药典中定义的那些。
[0105]
在一些实施方案中，在先前列举的条件下，如本文所公开的提取物的指甲花醌含量在3个月内降低不大于50％，有利地不大于40％，特别地不大于30％，有利地不大于20％，甚至更有利地不大于15％或10％。
[0106]
有利地，在先前列举的条件下，如本文所公开的提取物的指甲花醌含量在6个月内降低不大于50％，有利地不大于40％，特别地不大于30％，有利地不大于20％，甚至更有利地不大于15％或10％。
[0107]
优选地，在先前列举的条件下在室温，如本文所公开的提取物的指甲花醌含量在12个月内降低不大于50％，有利地不大于40％，特别地不大于30％，有利地不大于20％，甚至更有利地不大于15％或10％。
[0108]
还可以在所谓的加速稳定性条件下评价如本文所公开的提取物的稳定性。这些条件是温度为40℃(
±
2)和rh为75％(
±
5)。如果最初存在于提取物中的指甲花醌的量在1个月内降低不大于50％，有利地不大于40％，特别地不大于30％，有利地不大于20％，甚至更有利地不大于10％，则如本文所公开的提取物的指甲花醌含量被评价为在加速稳定性条件下“随着时间的推移是稳定的”。
[0109]
有利地，在先前列举的加速稳定性条件下，如本文所公开的提取物的指甲花醌含量在3个月内降低不大于50％，有利地不大于40％，特别地不大于30％，有利地不大于20％，甚至更有利地不大于10％。
[0110]
特别地，在先前列举的加速稳定性条件下，如本文所公开的提取物的指甲花醌含量在6个月内降低不大于50％，有利地不大于40％，特别地不大于30％，有利地不大于20％，甚至更有利地不大于10％。
[0111]
如本文所公开的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计7％至60％，特别地7％至50％或7％至40％的指甲花醌。有利地，如本文所公开的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计至少7％，有利地至少8％，优选至少10％，更有利地至少15％的指甲花醌；以相对于干燥提取物的总重量表示百分比(在加入任何干燥载体之前)。在一些实施方案中，如本文所公开的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计15％至40％的指甲花醌。可以根据以下实施例中描述的hplc测定方法(方法1)来确定指甲花醌含量。
[0112]
在一些实施方案中，如本文所公开的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计不大于2％，优选不大于1.5％，尤其不大于1％的蛋白质、肽或氨基酸，有利地包含相对于干燥提取物的总重量以重量计0至1％，更有利地0.1至1％的蛋白质、肽或氨基酸。
[0113]
可以根据以下实施例描述的方法(方法2)，通过茚三酮分光光度法来分析游离氨基酸、肽和蛋白质。
[0114]
在一些实施方案中，如本文所公开的提取物还包含叶绿素，特别是叶绿素a和/或叶绿素b，总叶绿素含量为相对于干燥提取物的总重量以重量计小于25％，尤其以重量计小
于20％，有利地相对于干燥提取物以重量计小于10％。
[0115]
在一些实施方案中，如本文所公开的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计不大于5％，优选不大于2％的叶绿素。有利地，如本文所公开的提取物不包含叶绿素。可以根据以下实施例中描述的方法(方法3)通过重量测定法来分析叶绿素。
[0116]
如本文所公开的提取物还可以包含天然存在于散沫花的地上部分，特别是散沫花的叶子和/或枝条中的任何化合物。
[0117]
在一些实施方案中，如本文所公开的提取物还包含：
[0118]-酚化合物，如没食子酸、香豆酸、2,3,4,6-四羟基苯乙酮和3,4,5-三羟基苯乙酮；
[0119]-黄酮类，如木犀草素、芹菜素、儿茶素(catechin)、3’,4’,5,7-四羟基黄酮、3’,5,7-三羟基-4
’‑
甲基黄酮；
[0120]-甾醇类，如β-谷甾醇；
[0121]-三萜类，如羽扇豆醇(lupeol)；和/或
[0122]-其糖杂体，如黑麦草苷(lalioside)、多花香叶酰苯a(myrciaphenone a)、1,2-二羟基-4-o-糖基氧基萘(也被称为4-o-β-d-吡喃葡萄糖苷)、木犀草素-4
’‑
o-葡萄糖苷、芹菜素-7-o-β-葡萄糖苷、木犀草素-3
’‑
o-葡萄糖苷、芹菜素-4
’‑
o-β-葡萄糖苷和木犀草素-6-c-新橙皮苷。
[0123]
更特别地，如本文所公开的提取物还包含：
[0124]-酚化合物，如没食子酸、香豆酸、2,3,4,6-四羟基苯乙酮和3,4,5-三羟基苯乙酮；
[0125]-黄酮类，如木犀草素、芹菜素、儿茶素、3’,4’,5,7-四羟基黄酮、3’,5,7-三羟基-4
’‑
甲基黄酮；和/或
[0126]-其糖杂体，如黑麦草苷、多花香叶酰苯a、1,2-二羟基-4-o-糖基氧基萘、木犀草素-4
’‑
o-葡萄糖苷、芹菜素-7-o-β-葡萄糖苷、木犀草素-3
’‑
o-葡萄糖苷、芹菜素-4
’‑
o-β-葡萄糖苷和木犀草素-6-c-新橙皮苷。
[0127]
上面具体化合物的化学结构列于下表1中：
[0128]
表1：可能存在于本发明的提取物中的化合物
[0129]
[0130][0131]
黄酮类(如木犀草素和芹菜素)具有许多令人关注的生物学性质，如自由基清除和抗氧化作用(romanov等人,neoplasma 2001,48(2),104-107)及抗炎活性，这些性质以及其吸收紫外线的能力是黄酮类能够提供免受uv辐射的原因(saewan等人,japs 2013,3(9),129-141)。尽管毛发光保护是一个不常提出的话题，但不应忽视uv辐射的化学作用及其对发干的影响(draelos,dermatol.clin.2006,24,81-84)。因此，具有光保护作用的化合物在旨在用于染发的化妆品组合物中的存在是特别令人关注的。
[0132]
木犀草素和芹菜素也是熟知的天然染料，可以用于给毛发和纺织品着色。
[0133]
此外，已显示芹菜素为毛发生长促进剂(huh等人arch.dermatol.res.,2009,301,381-385)。
[0134]
多酚类(如2,3,4,6-四羟基苯乙酮)和酚酸类(如对香豆酸)也具有抗氧化和光保护性质(nichols等人,arch.dermatol.res.2010,302,71-83)。
[0135]
在一些实施方案中，如本文所公开的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计1％至40％，特别地2％至30％的酚化合物。可以根据本文所描述的方法(方法4)通过分光光度法来测定酚化合物含量。
[0136]
在一些实施方案中，如本文所公开的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计不大于5％，有利地0.1至5％，更有利地0.5至5％的糖。可以根据本文所描述的方法(方法5)通过使用二硝基水杨酸的比色法来测定糖含量。
[0137]
因此，更具体地，散沫花的地上部分的提取物，特别是散沫花的叶子和/或枝条的提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计7至60％的指甲花醌，其中指甲花醌来源于糖基化的指甲花醌衍生物如指甲花苷的酶水解，其中所述提取物进一步包含木犀草素、芹菜素和2,3,4,6-四羟基苯乙酮。
[0138]
如本文所公开的提取物可以进一步包含香豆酸，特别是对香豆酸。
[0139]
如本文所公开的提取物可以进一步包含3,4,5-三羟基苯乙酮和/或1,2-二羟基-4-o-糖基氧基萘。
[0140]
如本文所公开的提取物可以进一步包含糖基化的木犀草素，特别是木犀草素-6-c-新橙皮苷。
[0141]
在一些实施方案中，散沫花的地上部分的提取物，特别是散沫花的叶子和/或枝条的提取物进一步包含2,3,4,6-四羟基苯乙酮，所述提取物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计7至60％的指甲花醌，其中指甲花醌来源于糖基化的指甲花醌衍生物如指甲花苷的酶水解。
[0142]
在一些实施方案中，如本文所公开的提取物可以为干燥提取物形式，有利地为粉末形式。
[0143]
在一些实施方案中，如本文所公开的提取物可以为标准化的提取物。
[0144]“标准化的提取物(standardized extract)”是指具有期望的/选定的指甲花醌含量的提取物。例如，对于化妆品应用而言，提取物中的指甲花醌含量可以为相对于干燥提取物的总重量以重量计0.6％至1.4％，有利地1至1.3％，特别地约1.3％。
[0145]
可以通过加入载体来获得该指甲花醌含量，所述载体选自单独的或混合的无蛋白载体。
[0146]
所述“载体”必须相对于提取物及其组分是惰性的：它不与提取物或其组分(更特别地指甲花醌)相互作用，有助于其保护作用，并能够使活性提取物或分子的最终含量标准化。它必须是“化妆品上可接受的”，这意味着，在本发明的情况下，它可用于制备化妆品组合物，通常是安全的、无毒的且既不是生物学上也不是其他方面所不期望的，并且对于化妆品用途(尤其是局部应用)是可接受的。
[0147]
载体可以选自丙二醇、戊二醇、甘油、丙二醇、甲基thf和戊醇。
[0148]
根据本发明的干燥提取物也可以是标准化的。
[0149]
对于干燥提取物，载体可以在提取物干燥期间充当支持物，并且优选选自糖和多糖衍生物，如果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖糊精、纤维素衍生物、淀粉(尤其是玉米、小麦或大米淀粉)、琼脂、树胶、粘质物(mucilage)；以及多元醇，如甘露醇、山梨醇、木糖醇等。特别地，其选自果糖、麦芽糖糊精和淀粉，尤其是大米淀粉。
[0150]
在本发明的框架内，载体优选为天然载体和/或来自可再生资源(而非化石资源)的天然来源的载体，这些载体可有利地通过尊重环境的方法获得。
[0151]
本发明更特别地涉及散沫花的地上部分的标准化干燥提取物，其包含相对于干燥提取物的总重量0.6至1.4重量％，有利地1至1.3重量％，更特别地约1.3重量％的指甲花醌，其中所述提取物进一步包含木犀草素、芹菜素和2,3,4,6-四羟基苯乙酮。提取物可以进一步包含3,4,5-三羟基苯乙酮和/或1,2-二羟基-4-o-糖基氧基萘。
[0152]
本发明更特别地涉及散沫花的地上部分的标准化干燥提取物，其包含相对于干燥提取物的总重量0.6至1.4重量％的指甲花醌，有利地1至1.3重量％，更特别地约1.3重量％的指甲花醌，其中所述提取物进一步包含2,3,4,6-四羟基苯乙酮。提取物可以进一步包含3,4,5-三羟基苯乙酮和/或1,2-二羟基-4-o-糖基氧基萘。
[0153]
如本文所公开的标准化干燥提取物可以进一步包含香豆酸，特别是对香豆酸。
[0154]
如本文所公开的标准化干燥提取物可以进一步包含糖基化的木犀草素，特别是木犀草素-6-c-新橙皮苷。
[0155]
如本文所公开的标准化干燥提取物可以进一步包含表1中公开的任何化合物。
[0156]
特别地，如本文所公开的标准化干燥提取物具有一个或多个以下的特征，有利地具有所有以下的特征(相对于标准化干燥提取物的总重量表示重量％)：
[0157]-标准化干燥提取物包含以重量计0.6至1.4％，有利地1至1.3％的指甲花醌；
[0158]-标准化干燥提取物包含以重量计0.2至3.0％的酚化合物；
[0159]-标准化干燥提取物包含0.05至1.0重量％的木犀草素；
[0160]-标准化干燥提取物包含0.01至0.5重量％的芹菜素；
[0161]-标准化干燥提取物包含0.05至1.0重量％的2,3,4,6-四羟基苯乙酮；
[0162]-标准化干燥提取物包含0.01至0.1重量％的香豆酸，特别是对香豆酸；
[0163]-标准化干燥提取物包含糖基化的木犀草素，特别是木犀草素-6-c-新橙皮苷；
[0164]-标准化干燥提取物包含不大于0.2重量％的蛋白质、肽或氨基酸，有利地其包含0至0.2重量％，有利地0.01至0.2重量％的蛋白质、肽或氨基酸；
[0165]-标准化干燥提取物不包含叶绿素；
[0166]-标准化干燥提取物包含不大于0.5重量％的糖化合物，有利地其包含0.01至0.5重量％，有利地0.05至0.5重量％的糖化合物。
[0167]
优选地，标准化干燥提取物符合上文定义的关于随着时间的推移的指甲花醌含量稳定性的规范，包括在加速条件下的稳定性的规范。
[0168]
因此，在室温(15℃-25℃)，相对湿度(rh)为60％且避光的情况下在1个月、3个月、6个月或12个月后，或者在40℃(
±
2℃)和相对湿度(rh)为75％(
±
5℃)的情况下在1个月、3个月、6个月后，指甲花醌含量降低不大于50％，有利地不大于40％，特别地不大于30％，有利地不大于20％，尤其不大于15％，有利地不大于10％，更有利地不大于5％。
[0169]
在一些实施方案中，标准化干燥提取物包含相对于标准化干燥提取物的总重量至
少80重量％，有利地至少90重量％，特别地至少92重量％的载体。
[0170]
组合物
[0171]
本发明还涉及一种组合物，特别是化妆品染料组合物，其包含如本文所公开的提取物或标准化干燥提取物，以及合适的赋形剂(如适用)。
[0172]
在一些实施方案中，本发明涉及一种组合物，特别是化妆品染料组合物，其包含如本文所公开的提取物或标准化干燥提取物，所述提取物或标准化干燥提取物进一步包含木犀草素、芹菜素和2,3,4,6-四羟基苯乙酮。提取物可以进一步包含3,4,5-三羟基苯乙酮和/或1,2-二羟基-4-o-糖基氧基萘。
[0173]
在一些实施方案中，本发明涉及一种组合物，特别是化妆品染料组合物，其包含如本文所公开的提取物或标准化干燥提取物，所述提取物或标准化干燥提取物进一步包含香豆酸和木犀草素-6-c-新橙皮苷。提取物可以进一步包含3,4,5-三羟基苯乙酮和/或1,2-二羟基-4-o-糖基氧基萘。
[0174]
将所述组合物优选配制成适合用作染色组合物，特别是外用和局部施用的化妆品组合物。
[0175]
可以将如本文所公开的组合物配制成适合局部施用(对于化妆品组合物)或外部施用的不同制剂的形式，尤其包括霜剂、乳剂、乳液、软膏、洗剂、油剂、水或水-醇或乙二醇(glycolic)溶液、粉末、喷雾剂、洗发剂、清漆(varnish)或任何其他外用产品。
[0176]
组合物不含通常存在于指甲花组合物中以稳定指甲花醌的稳定剂。
[0177]
如本文所公开的组合物有利地不含由合成染料(如二氨基甲苯和二氨基苯，特别是最常使用的ppd(对二苯二胺))或重金属组成的添加剂(wang等人j.environ.anal.toxicol.2016,6(3)；wang等人j.chromatogr.b 2011,879,1795
–
1801)。
[0178]
组合物有利地为化妆品染料组合物，其包含至少一种化妆品上可接受的赋形剂。
[0179]
如本文所使用的术语“化妆品上可接受的赋形剂”是指该赋形剂可用于制备化妆品组合物，其通常是安全的、无毒的且既不是生物学上也不是其他方面所不期望的，并且其对于化妆品用途(尤其是局部应用)是可接受的。
[0180]
如本文所公开的组合物可以包含至少一种化妆品上可接受的赋形剂，其选自表面活性剂、增稠剂、防腐剂、香料、染料、化学或矿物过滤剂、保湿剂、温泉水(thermal water)等。技术人员知晓通过使用他们的常识来调节根据本发明的组合物的制剂。
[0181]
在一些实施方案中，组合物，特别是化妆品染料组合物包含以重量计0.01至50％，尤其1至40％，特别地2至30％的如本文所公开的提取物，相对于组合物的总重量以干燥提取物表示提取物的重量。
[0182]
在一些实施方案中，组合物，特别是化妆品染料组合物包含以重量计1至20％，尤其5至20％，特别地10至20％的如本文所公开的标准化提取物，相对于组合物的总重量以干燥提取物表示标准化提取物的重量。
[0183]
优选地，组合物，特别是化妆品染料组合物具有相对于组合物的总重量以指甲花醌的重量计0.2％至2％，尤其0.5至1.5％的指甲花醌含量。
[0184]
特别地，组合物，特别是化妆品染料组合物具有相对于组合物的总重量以重量计1.0％至1.3％，或约1.3％的指甲花醌含量。
[0185]
可以通过加入载体来获得该指甲花醌含量，所述载体选自单独的或混合的无蛋白
载体。载体尤其可以选自丙二醇、戊二醇、甘油、丙二醇、甲基thf和戊醇。
[0186]
当化妆品染料组合物为粉末形式时，载体优选选自糖和多糖衍生物，如果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖糊精、纤维素衍生物、淀粉(尤其是玉米、小麦或大米淀粉)、琼脂、树胶、粘质物；以及多元醇，如甘露醇、山梨醇、木糖醇等。典型地，载体为果糖、麦芽糖糊精或淀粉，特别是大米淀粉。
[0187]
当组合物，特别是化妆品染料组合物为粉末形式时，技术人员可以通过他们熟知的任何方法来调节其颗粒尺寸。
[0188]
特别地，化妆品染料组合物可以为粉末形式，其颗粒尺寸小于250μm。
[0189]
优选地，组合物，特别是化妆品染料组合物包含相对于干燥提取物的总重量以重量计不大于2％的蛋白质、肽或氨基酸。
[0190]
组合物，特别是化妆品染料组合物还可以包含一种或多种另外的染料和/或颜料。
[0191]
应理解，组合物的指甲花醌含量随着时间的推移是稳定的。
[0192]
因此，在室温(15℃-25℃)、相对湿度(rh)为60％且避光的情况下1个月、3个月、6个月或12个月后，所述提取物的指甲花醌含量降低不大于60％，特别地不大于50％，优选不大于40％，有利地不大于30％，特别地不大于20％，尤其不大于15％，有利地不大于10％。
[0193]
本发明还涉及一种用于使角蛋白纤维染色的美容方法，其包括将根据本发明的组合物应用到角蛋白纤维上，任选地随后冲洗。
[0194]“角蛋白纤维”是指存在于表皮和毛发和指甲中的角蛋白。
[0195]
本发明还涉及一种用于在皮肤上纹身的方法。
[0196]
本发明的主题还包括一种纺织品或家具染料，其包含根据本发明的提取物。这种染料还可以包含一种或多种另外的染料和/或颜料。根据本发明的染料还可以包含技术人员已知的任何佐剂，技术人员知晓如何通过使用其常识来调节根据本发明的染料的制剂。本发明还涉及这种染料用于使纺织品或木纤维染色的用途。
[0197]
本发明还涉及一种植物油墨，其包含如本文所公开的提取物或如本文所公开的组合物。油墨可以包含合适的赋形剂，如油、树脂及其混合物。
附图说明
[0198]
图1表示根据实施例1的方法获得的提取物的归一化uhplc-uv色谱图。
具体实施方式
[0199]
以下实施例阐明了本发明。
[0200]
实施例1：
[0201]
在30-40℃，用6体积水提取50g未粉碎的散沫花叶子持续30分钟。在室温将6体积正丁醇加入至该溶液。将该混合物搅拌30分钟。倾析后，回收上层的丁醇相，将水相分离，因为其几乎不含指甲花醌。有机相通过水而浓缩。
[0202]
通过hplc测定有机相中的指甲花醌含量。加入足量的麦芽糖糊精以获得含有1.1至1.3重量％的指甲花醌的混合物。
[0203]
将浓缩物干燥以获得粉末。
[0204]
表征
[0205]
a)结构分析
[0206]
材料和方法
[0207]
在装备了四元泵、自动进样器、在线脱气机、自动恒温柱箱和dad检测器(200-500nm)的waters acquity uhplc系统上进行色谱分离。在35℃使用装备了vanguard
tm
前置柱(5mm x 2.1)的acquity uplc beh shield rp18柱(100mm
×
2.1,1.7μm)(waters corporation,milford,美国)，并将流速设置为0.4ml/min。流动相由(a)含0.1％甲酸的水和(b)乙腈和(c)甲醇(作为洗涤溶剂)的线性梯度系统组成：0-9min,2％-100％b；9-9.55min,维持100％b；9.55-9.70min,0％-100％c；9.7-10.2min,维持100％c；10.20-10.35min,0％-100％b；10.35-10.85min,维持100％b；10.85-11min,0％-98％a；进行98％a-2％b持续1min用于使柱平衡。
[0208]
通过高分辨率质谱、1d-nmr和2d-nmr实验(1h nmr、
13
c nmr、dept、cosy、hmbc、hsqc)鉴定化合物。
[0209]
结果
[0210]
uhplc-uv色谱图
[0211]
所得的uhplc-uv色谱图显示在图1中。可以观察到的峰与以下化合物相关：
[0212]
分辨时间化合物4.47指甲花醌3.382,3,4,6-四羟基苯乙酮5.34木犀草素5.96芹菜素
[0213]
注意到糖基化木犀草素(特别是木犀草素-6-c-新橙皮苷)和香豆酸的存在。
[0214]
b)定量分析：实验条件
[0215]
通过用c18柱(xbridge 100c18；3.5mm,150mm x 4.6mm)进行的分析型hplc滴定木犀草素、芹菜素，所述hplc使用梯度条件(见下文)，以h2o/三氟乙酸0.1％(a)和乙腈/三氟乙酸0.1％(b)作为洗脱剂：
[0216]
梯度条件：t0 a 18％b 82％；t1 min:a 18％b 82％；10min a 50％b 50％；10.1min:a 18％b 82％
[0217]
uv检测在340nm(对于芹菜素)和310nm(对于木犀草素)。流速为1ml/min，温度为40℃。使用纯的木犀草素、芹菜素和对香豆素用于校准。
[0218]
方法1：通过hplc的指甲花醌分析
[0219]
该方法可以应用于：
[0220]
a.提取物中指甲花醌的分析
[0221]
b.总指甲花醌的分析，所述总指甲花醌在散沫花的地上部分中以游离形式或糖基化的指甲花醌衍生物形式存在，通过酸水解获得，由此定量植物的指甲花醌潜力，
[0222]
c.通过酶形成的指甲花醌的分析。
[0223]
■
试剂
[0224]
指甲花醌》97％(hplc)sigma-ref:h46805
[0225]
分析用二氯甲烷。
[0226]
分析用硫酸。
[0227]
分析用甲醇。
[0228]
hplc级水。
[0229]
hplc级乙腈。
[0230]
hplc级三氟乙酸。
[0231]
■
hplc条件
[0232]-柱：xbridge c18,3.5μm,4.6x 150mm waters
[0233]
炉温(furnace)：40℃
[0234]-溶剂：s-a：0.1％三氟乙酸的水溶液。
[0235]
s-b：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。
[0236]-梯度：t0 min 40％s
–
a；t 1min 40％s
–
a；t 10min 5％s
–
a；t 11min 5％s
–
a；t 11.1min 40％s
–
a.
[0237]-波长：λ＝278nm。
[0238]-流速：1ml/min
[0239]-进样：10μl。
[0240]
■
样品制备：
[0241]
对于完整或粗粉碎的叶子：将50g叶子粉碎，然后通过0.355μm筛子过筛。
[0242]
对于叶子粉末：按原样使用50g叶子粉末。
[0243]
■
溶液的制备
[0244]
●
对照溶液：
[0245]
在1/1甲醇/乙醇中的0.3mg/ml的指甲花醌溶液。在1/1甲醇/水中稀释至1/10、1/20、1/100。
[0246]
●
测试溶液：
[0247]-测试溶液a(提取物中存在的指甲花醌的分析)
[0248]
将50mg提取物溶解于100ml的1/1甲醇/水中。用超声波溶解。在acrodisc gf ghp上过滤。进样10μl。
[0249]-测试溶液b(总指甲花醌的分析)
[0250]
将80mg叶子粉末加入容量瓶中。加入50ml的2n h2so4。加热至97℃持续30min。冷却。加入甲醇适量至100ml。在acrodisc gf ghp 0.45μm上过滤溶液。进样10μl滤液。
[0251]-测试溶液c(通过酶形成的指甲花醌的分析)
[0252]
将80mg叶子粉末加入容量瓶中。加入50ml脱矿物质水。放置于30至40℃的超声波浴中持续30min。冷却。加入甲醇适量至100ml。在acrodisc gf ghp 0.45μm上过滤溶液。进样10μl滤液。
[0253]
■
结果
[0254]
使用通过对照溶液计算出的回归线以确定：
[0255]
a.提取物的指甲花醌含量，
[0256]
b.总指甲花醌含量，和/或
[0257]
c.通过酶形成的指甲花醌的含量。
[0258]
方法2：含氮化合物(氨基酸、蛋白质)的分析
[0259]
可以通过茚三酮分光光度法在水解之前或之后分析游离氨基酸和蛋白质。以相对
于天冬酰胺的氨基酸百分比表示结果。
[0260]
■
总蛋白质和氨基酸的分析
[0261]
√原理
[0262]
酸水解后通过茚三酮试剂的氨基酸比色分析。以相对于天冬酰胺的总氨基酸百分比表示结果。
[0263]
√试剂
[0264]
●
柠檬酸盐缓冲液(ph＝5)
[0265]
将2.1g柠檬酸溶解于20ml水中，加入20ml的1n氢氧化钠，并用水调节至50ml。
[0266]
●
茚三酮试剂：
[0267]
将0.08g氯化锡(ii)(sncl2，2h2o)溶解于50ml柠檬酸盐缓冲液(ph＝5)中。
[0268]
将2g茚三酮溶解于50ml乙二醇单甲醚(egme)中。
[0269]
将两种溶液混合。
[0270]
●
6n盐酸
[0271]
稀释至浓盐酸(36％)的1/2。
[0272]
●
稀释剂
[0273]
将100ml的1-丙醇与100ml水混合。
[0274]
√溶液的制备
[0275]
●
校准范围的制备
[0276]
将17mg天冬酰胺溶解于100ml水中。
[0277]
●
测试溶液的制备
[0278]
根据待分析的样品，称取约30至200mg提取物(pe1)至螺纹管中，加入2ml的6n hcl。
[0279]
密封，然后在110℃放置约16小时。
[0280]
用3n氢氧化钠中和(甲基红改变颜色)，然后用水调节至20ml。
[0281]
√分析
[0282][0283][0284]
搅拌并在100℃的水浴中放置20分钟。
[0285]
在冰浴中冷却。
[0286]
用稀释剂调节至10ml。
[0287]
测量不同溶液在570nm处的相对于空白的吸光度。
[0288]
■
计算
[0289]
绘制校准曲线。
[0290]
从中推导出测试溶液中以天冬酰胺表示的总氨基酸浓度(q
aat
)。
[0291]
提取物的总氨基酸含量(t
aat
)由下式给出：
[0292][0293]
其中:q
aat
以mg/ml为单位
[0294]
pe1以mg为单位
[0295]
方法3：叶绿素的重量分析
[0296]
可以通过用庚烷洗涤提取物后获得的重量来评价提取物中的叶绿素含量。用10体积的甲醇处理提取物。搅拌15min后，将溶液过滤。将上清液干燥并构成含有叶绿素的级分。
[0297]
方法4：酚化合物的分光光度法分析
[0298]
可以根据欧洲药典(9.0,2.8.14版)的方法通过分光光度法评价提取物中酚化合物的含量。
[0299]
通过将25mg提取物溶解在100ml水中制备待测溶液。
[0300]
参照连苯三酚表示酚化合物的含量。
[0301]
方法5：糖化合物在水解前后的比色分析
[0302]
原理：在水解前后，与葡萄糖相比，通过二硝基水杨酸(dns)的糖化合物的比色测定。结果表示为糖化合物相对于葡萄糖的百分比。
[0303]
试剂：
[0304]
dns试剂：将30g双酒石酸钠和双酒石酸钾溶解于50ml水中。加入20ml的2n氢氧化钠。在稍微加热的同时溶解1g二硝基水杨酸(dns)。用水定容至100ml。
[0305]
溶液的制备：
[0306]
校准范围的制备：将5mg葡萄糖溶解在10ml水中。
[0307]
水解测试溶液的制备(总糖化合物)：称取约1g提取物(pe2)。加入1ml的4n h2so4。加热回流2小时。用1n氢氧化钠中和，并转移到20ml容量瓶中。用水定容至20ml。
[0308]
非水解测试溶液的制备(游离糖化合物＝单糖)：在20ml容量瓶中称取约10g提取物(pe3)。用水定容至20ml。
[0309]
剂量：溶液根据下表配制(dosed)：
[0310] t 0.5t1t1.5t2测试空白对照溶液(ml)0.511.52
‑‑
测试溶液(ml)
‑‑‑‑
1-水(ml)1.510.5012dns111111
[0311]
摇动，然后在100℃的水浴中放置5分钟。在冰浴上冷却，并用水定容至10ml。测量不同溶液在540nm处的相对于空白的吸光度。
[0312]
计算：
[0313]
绘制校准曲线。
[0314]
推导出测试溶液中以葡萄糖表示的总糖化合物(qsrt)和游离糖(qsrl)的浓度。提取物的总糖化合物(tsrt)的滴度由下式提供：
[0315][0316]
其中q
srt
以mg/ml为单位，pe2以mg为单位
[0317]
提取物的游离糖化合物(tsrl)的滴度由下式提供：
[0318][0319]
其中q
srl
以mg/ml为单位，pe3以mg为单位。