1.本公开涉及食品加工的技术领域，尤其涉及一种猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素的方法。


背景技术：

2.裙带菜为多年生大型褐藻，是我国养殖的大型经济海藻之一。裙带菜具有很高的经济价值及药用价值，不仅含有丰富的蛋白质，维生素和矿物质，还含有褐藻酸、甘露醇、褐藻糖胶、高不饱和脂肪酸、岩藻黄素、有机碘、甾醇类化合物、膳食纤维等多种具有独特生理功能的活性成分。
3.国内的裙带菜加工大多处于初级阶段，主要生产冻干品、盐渍品和碎切品，以原料出口日本。传统产业生产的多为褐藻酸、碘、甘露醇等附加值低产品，有关裙带菜的加工、开发和研究仍处于起步阶段，这导致裙带菜利用率低，不仅是对裙带菜资源的浪费，也限制了本产业的发展。
4.利用微生物发酵转化食品原料，不仅可以将食品原料中的大分子转化成易于人体吸收的营养物质，还可以在发酵过程中产生多种有益的活性物质，可以大大提高产品的附加值。目前，生物发酵法应用于海藻加工尚处于起步阶段，用于海藻发酵加工的细菌主要有乳酸菌、醋酸菌等，在海藻发酵中主要用来加工泡菜和乳酸饮料，也有在海藻发酵饮料中加入胚芽乳杆菌做防腐剂的报道。
5.真菌类如米曲霉菌、毛霉菌、黑曲霉菌等，多用于海藻酱、海藻调味汁、酱油等发酵型调味品的发酵，也有用鱼露发酵盐渍裙带菜制作发型裙带菜调味酱的报道。酵母类如耐高温酒精活性干酵母、葡萄酒酵母等，广泛应用于发酵型海藻酒，主要是混合海藻发酵酒，也有用于酵母发酵制作饮料的报道。目前关于利用大型食用真菌发酵裙带菜的研究还未见报道。


技术实现要素：

6.为提高裙带菜的附加值，本公开提供了一种猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素的方法，对于提高裙带菜的经济价值及其附加产值具有积极的促进作用。
7.本公开提供了一种猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素的方法，包括：
8.步骤一、液体种子培养基的配制：称取以下重量份数的组分：马铃薯片100-300份，葡萄糖15-25份，蛋白胨2-8份，磷酸二氢钾0.5-3份，硫酸镁0.5-1份；将上述重量份数的马铃薯片煮沸过滤后，将其过滤液与其它组分一起，加入至1000份重量份数的水中，自然ph，得到液体种子培养基；
9.步骤二、裙带菜发酵培养基的配制：将盐渍裙带菜反复冲洗浸泡复水至总重达4～5倍，将脱盐复水后的裙带菜过胶体磨，得到裙带菜浆液，灭菌，并冷却至室温待用，得到裙带菜发酵培养基；
10.步骤三、猴头菇的液体种子培养：将活化后的猴头菇菌株切成小块，接种于所述液
体种子培养基中，在培养温度25-30℃，转速100-200r/min条件下，摇瓶培养5-10d；得到猴头菇液体种子培养液；
11.步骤四、猴头菇的深层发酵培养：将所述猴头菇液体种子培养液按照5-10％接种量，接入所述裙带菜发酵培养基中，在培养温度25-30℃，转速100-200r/min条件下，摇瓶培养5-10d；得到猴头菇裙带菜发酵培养液；
12.步骤五、裙带菜酵素的制备：将所述猴头菇裙带菜发酵培养液过滤得上清液，灭菌，得到裙带菜酵素。
13.根据实施例的一个优选方式，在所述步骤一中，称取以下重量份数的组分：马铃薯片200份，葡萄糖20份，蛋白胨5份，磷酸二氢钾1.5份，硫酸镁0.75份。
14.根据实施例的一个优选方式，在所述步骤三中，将活化后的猴头菇菌株切成小块，以10块0.2cm
×
0.2cm的接种量接种于250ml锥形瓶分装有100ml液体种子培养基中。
15.根据实施例的一个优选方式，在所述步骤二中，在培养温度28℃，转速150r/min条件下，摇瓶培养7d。
16.根据实施例的一个优选方式，在所述步骤四中，在培养温度28℃，转速150r/min条件下，摇瓶培养7d。
17.根据实施例的一个优选方式，在所述步骤五中，将所述猴头菇裙带菜发酵培养液经100目滤布过滤得上清液。
18.根据实施例的一个优选方式，在所述步骤五中，所述灭菌的灭菌温度为115℃，灭菌时间为20℃。
19.本公开还提供了一种裙带菜酵素的用途，应用于抗幽门螺杆菌。
20.采用上述技术方案后，本公开具有以下有益效果：
21.本公开首次提供了一种大型食用真菌制备裙带菜的方法，即采用猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素的方法。本公开得到的裙带菜酵素，无腥味，且具有更高的抗幽门螺杆菌的功能。由于海藻类原料本身具有较厚的细胞壁，有效成分难以溶出，目前，传统的乳酸菌发酵海藻通常需要发酵前进行预处理，利用添加酶的方式破坏细胞结构，再接入乳酸菌发酵；而本公开采用了不同的工艺，不需要加入酶进行发酵前预处理，利用猴头菇自身丰富的酶系，实现对海藻的细胞壁进行充分的降解。
附图说明
22.附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
23.图1是本公开的工艺流程图。
具体实施方式
24.下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
25.需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可
以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
26.本公开实施例裙带酵素液感官评定方法如下：
27.产品在室温下贮存24h，请10位不同人员根据产品色泽、香味、滋味以及组织状态等因素，按评分标准进行评分，满分为100分。最终统计评分结果。
28.表1感官评分标准(满分100分)
[0029][0030]
本公开实施例抗幽门螺杆菌的生物活性测定方法如下：
[0031]
用琼脂稀释法来测定供试材料的最低抑菌浓度(mic)。琼脂稀释法测定mic：(1)药物平板的制备：首先将测试的样液用二甲基亚砜(dmso)溶液配制成1024mg/ml的母液，过滤除菌后，再用无菌水倍比稀释到512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125mg/ml的浓度系列，dmso在介质中的浓度小于1％。将1ml配制好的测试溶液与保温于50℃的9ml哥伦比亚培养基充分混匀，浇制冷却即成。(2)转接实验菌(涂菌)：用微量取样器吸取稀释好的1
×
108cfu/ml幽门螺杆菌(hp)的菌悬液0.1ml均匀地涂抹在培养基表面，倒置于37℃烘箱中15min后取出，使琼脂表面干燥，备用。(3)确定mic：将待测培养皿在微需氧袋(含85％n2，10％co2和5％o2)中，保温37℃培养72h，观察幽门螺杆菌(hp)生长情况，以完全没有菌生长的样品最低浓度为最低抑菌浓度(mic)值。所有试验重复3次。
[0032]
本公开提供了一种猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素的方法，其工艺流程如图1所示，包括以下步骤：
[0033]
步骤一、液体种子培养基的配制：称取以下重量份数的组分：马铃薯片100-300份，葡萄糖15-25份，蛋白胨2-8份，磷酸二氢钾0.5-3份，硫酸镁0.5-1份；将上述重量份数的马铃薯片煮沸过滤后，将其过滤液与其它组分一起，加入至1000份重量份数的水中，自然ph，得到液体种子培养基；
[0034]
步骤二、裙带菜发酵培养基的配制：将盐渍裙带菜反复冲洗浸泡复水至总重达4～5倍，将脱盐复水后的裙带菜过胶体磨，得到裙带菜浆液，灭菌，并冷却至室温待用，得到裙带菜发酵培养基；
[0035]
步骤三、猴头菇的液体种子培养：将活化后的猴头菇菌株切成小块，接种于所述液体种子培养基中，在培养温度25-30℃，转速100-200r/min条件下，摇瓶培养5-10d；得到猴头菇液体种子培养液；
[0036]
步骤四、猴头菇的深层发酵培养：将所述猴头菇液体种子培养液按照5-10％接种量，接入所述裙带菜发酵培养基中，在培养温度25-30℃，转速100-200r/min条件下，摇瓶培养5-10d；得到猴头菇裙带菜发酵培养液；
[0037]
步骤五、裙带菜酵素的制备：将所述猴头菇裙带菜发酵培养液过滤得上清液，灭菌，得到裙带菜酵素。
[0038]
本公开首次提供了一种大型食用真菌制备裙带菜酵素的方法，即采用猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素，得到的裙带菜酵素液经发酵后，无腥味，且具有更高的抗幽门螺杆菌的功能。利用大型食用真菌具有丰富的酶系，在发酵过程能产生包括淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，本公开利用猴头菇液态发酵裙带菜，可以利用裙带菜中丰富的纤维素和蛋白质等营养物质，将裙带菜中的有效物质释放，同时猴头菇发酵可以产生许多活性物质，使得制备的产品具有更高的附加值，同时提升了猴头菇和裙带菜的经济价值，也为海洋产品的开发和海洋经济作物的深度利用提供了思路。
[0039]
实施例1
[0040]
一种猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素的方法，包括以下步骤：
[0041]
步骤一、液体种子培养基的配制：100g马铃薯片煮沸过滤液，葡萄糖15g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，以上材料加入至1000ml水中，ph自然。
[0042]
步骤二、裙带菜发酵培养基的配制：将盐渍裙带菜反复冲洗浸泡复水至总重达4～5倍，将脱盐复水后的裙带菜过胶体磨，得到裙带菜浆液。将配置好的发酵培养基灭菌，并冷却至室温待用。
[0043]
步骤三、猴头菇的液体种子培养：将活化后的猴头菇菌株切成小块，以10块0.2cm
×
0.2cm的接种量接种于250ml锥形瓶分装有100ml液体种子培养基中，25℃，200r/min条件下，摇瓶培养5d。
[0044]
步骤四、猴头菇的深层发酵培养：按照5％接种量，接入250ml锥形瓶分装有100ml裙带菜发酵培养基中，25℃，200r/min条件下，摇瓶培养5d。
[0045]
步骤五、裙带菜酵素液的制备：将猴头菇裙带菜发酵培养液经100目滤布过滤得上清液，将上清液经105℃，10min灭菌，即制得裙带菜酵素。
[0046]
实施例2
[0047]
一种猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素的方法，包括以下步骤：
[0048]
步骤一、液体种子培养基的配制：200g马铃薯片煮沸过滤液，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.75g，以上材料加入至1000ml水中，ph自然。
[0049]
步骤二、裙带菜发酵培养基的配制：将盐渍裙带菜反复冲洗浸泡复水至总重达4～5倍，将脱盐复水后的裙带菜过胶体磨，得到裙带菜浆液。将配置好的发酵培养基灭菌，并冷却至室温待用。
[0050]
步骤三、猴头菇的液体种子培养：将活化后的猴头菇菌株切成小块，以10块0.2cm
×
0.2cm的接种量接种于250ml锥形瓶分装有100ml液体种子培养基中，28℃，150r/min条件下，摇瓶培养7d。
[0051]
步骤四、猴头菇的深层发酵培养：按照8％接种量，接入250ml锥形瓶分装有100ml裙带菜发酵培养基中，28℃，150r/min条件下，摇瓶培养7d。
[0052]
步骤五、裙带菜酵素液的制备：将猴头菇裙带菜发酵培养液经100目滤布过滤得上清液，将上清液经115℃，20min灭菌，即制得裙带菜酵素。
[0053]
实施例3
[0054]
一种猴头菇液态发酵制备裙带菜酵素的方法，包括以下步骤：
[0055]
步骤一、液体种子培养基的配制：300g马铃薯片煮沸过滤液，葡萄糖25g，蛋白胨8g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1g，以上材料加入至1000ml水中，ph自然。
[0056]
步骤二、裙带菜发酵培养基的配制：将盐渍裙带菜反复冲洗浸泡复水至总重达4～5倍，将脱盐复水后的裙带菜过胶体磨，得到裙带菜浆液。将配置好的发酵培养基灭菌，并冷却至室温待用。
[0057]
步骤三、猴头菇的液体种子培养：将活化后的猴头菇菌株切成小块，以10块0.2cm
×
0.2cm的接种量接种于250ml锥形瓶分装有100ml液体种子培养基中，30℃，100r/min条件下，摇瓶培养10d。
[0058]
步骤四、猴头菇的深层发酵培养：按照10％接种量，接入250ml锥形瓶分装有100ml裙带菜发酵培养基中，30℃，100r/min条件下，摇瓶培养10d。
[0059]
步骤五、裙带菜酵素液的制备：将猴头菇裙带菜发酵培养液经100目滤布过滤得上清液，将上清液经115℃，20min灭菌，即制得裙带菜酵素。
[0060]
对比例1
[0061]
一种制备裙带菜酵素的方法，包括以下步骤：
[0062]
步骤一、裙带菜液的配制：将盐渍裙带菜反复冲洗浸泡复水至总重达4～5倍，将脱盐复水后的裙带菜过胶体磨，得到裙带菜浆液。将配置好的发酵培养基灭菌，并冷却至室温待用。
[0063]
步骤二、加入8％生理盐水，接入250ml锥形瓶分装有100ml裙带菜发酵培养基中，28℃，150r/min条件下，摇瓶培养7d。
[0064]
步骤三、裙带菜液的制备：将裙带菜发酵培养液依次经100目滤布过滤得上清液，将上清液经115℃，20min灭菌，即制得裙带菜酵素。
[0065]
对比例2
[0066]
一种制备裙带菜酵素的方法，包括以下步骤：
[0067]
步骤一、液体种子培养基的配制：200g马铃薯片煮沸过滤液，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.75g，以上材料加入至1000ml水中，ph自然。
[0068]
步骤二、发酵培养基的配制：200g马铃薯片煮沸过滤液，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.75g，以上材料加入至1000ml水中，ph自然。
[0069]
步骤三、猴头菇的液体种子培养：将活化后的猴头菇菌株切成小块，以10块0.2cm
×
0.2cm的接种量接种于250ml锥形瓶分装有100ml液体种子培养基中，28℃，150r/min条件下，摇瓶培养7d。
[0070]
步骤四、猴头菇的深层发酵培养：按照8％接种量，接入250ml锥形瓶分装有100ml裙带菜发酵培养基中，28℃，150r/min条件下，摇瓶培养7d。
[0071]
步骤五、猴头菇液的制备：将猴头菇发酵培养液经100目滤布过滤得上清液，将上清液经115℃，20min灭菌，即制得裙带菜酵素。
[0072]
本公开对实施例1-3及对比例1-2的裙带菜酵素的感官进行测试，口感测试结果如表2所示。
[0073]
表2感官评定值(分)
[0074][0075]
由表2可以看出，不经发酵处理的裙带菜(对比例1)腥味重，味道差；而经猴头菇发酵后口感更佳，具有裙带菜的香气和猴头菇的发酵香味，且无腥味。实施例2的口感最佳，裙带菜的香味与发酵味协调，颜色清亮。
[0076]
本公开对实施例1-3及对比例1-2的裙带菜酵素进行抗幽门螺杆菌的生物活性测定:用琼脂稀释法来测定供试材料的最低抑菌浓度(mic)，结果如表3所示。
[0077]
表3抗幽门螺杆菌的mic值(mg/ml)
[0078][0079]
由表3可以看出，对比例1不具有抗幽门螺杆菌作用，而实施例1-3及对比例2均有抗幽门螺杆菌作用，而裙带菜发酵液比猴头菇发酵液显示了更强的幽门螺杆菌的抑制活性，其中实施例1-3的抑菌活性存在差异，而实施例3表现最强的抑菌活性，mic为0.25mg/ml。这可能是由于裙带菜经过猴头菇发酵后，猴头菇产生的包括淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，更多利用裙带菜中丰富的纤维素和蛋白质等营养物质，将裙带菜中的有效物质释放，同时猴头菇发酵可以产生水溶性多糖等活性物质，使得制备的产品具有更高的抑菌活性。
[0080]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
[0081]
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。