1.本发明属于复合纤维制备技术领域，尤其涉及一种重组蛋白复合纤维的制备方法及应用。


背景技术：

2.纤维素是一种来源丰富的天然高分子材料，其主要来源包括木头、植物纤维、细菌、被囊动植物。纤维素是由葡萄糖缩合形成的高分子链，其聚合度达1000-30000，长度多在500-15000nm。分子链与分子链之间通过氢键形成具有刚性的晶体区以及非刚性的不定型区的结构，其刚性的结构可以为植物细胞提供强有力的支撑从而维持细胞的基本形态。按照文献报道晶体区的理论强度可以达到75gpa，弹性模量更是可以达到150gpa。然而高强度的纤维素无法同时兼具高韧性的特点，据现有文献报道的大部分基于纤维素制备的纤维韧性基本上处于20mj/m3以下。
3.纳米纤维素则是通过物理法、化学法、生物方法等制备的具有纳米尺寸的纤维素，纳米纤维素能够在水中较好的分散形成稳定的胶体。纳米纤维素不仅具有纤维素高强度、良好生物相容性的特点，还进一步表现出纳米粒子的特性如高比表面积以及较好的透明度。然而纤维素的纳米化并没有解决其韧性差的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种重组蛋白复合纤维、其制备方法及应用，本发明利用重组蛋白提升纳米纤维素韧性和延展性，同时还具有良好的生物相容性。
5.本发明提供一种重组蛋白复合纤维，由重组蛋白和纳米纤维素共价交联得到；
6.所述重组蛋白为序列为mgagpgvg[(vpgkg)9vpgvg]
n-1
(vpgkg)9vpgwphhhhhh的elp重组蛋白，n为2、4、8或16；所述重组蛋白用于提高纳米纤维素的力学性能；
[0007]
所述纳米纤维素与重组蛋白的质量比为(5～50)：1；
[0008]
所述共价交联为先用edc/nhs处理，然后与重组蛋白或者聚赖氨酸反应。
[0009]
优选的，所述纳米纤维素为tempo氧化法处理纤维素木浆后利用机械法制备得到的纳米纤维素；所述纳米纤维素的浓度为5～20mg/ml。
[0010]
本发明提供如上文所述的重组蛋白复合纤维的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
a)将重组蛋白溶液和纳米纤维素混合，然后在酸溶液中挤出成型，得到成型的纤维；
[0012]
b)将所述成型的纤维在含有edc/nhs交联剂的缓冲溶液中进行反应，然后将反应后的纤维在含有重组蛋白或者聚赖氨酸的缓冲溶液中进行反应，得到重组蛋白复合纤维；
[0013]
或者，
[0014]
c)将多根所述成型的纤维汇集形成单股纤维，将所述单股纤维按照步骤b)中的方法在含有edc/nhs交联剂的缓冲溶液中进行反应，然后将反应后的纤维在含有重组蛋白或者聚赖氨酸的缓冲溶液中进行反应，得到重组蛋白复合纤维。
[0015]
优选的，所述重组蛋白按照以下步骤获得：
[0016]
用lb培养液及tb培养液培养k
18
、k
36
、k
72
、k
144
工程菌，破碎菌体后收集上清液并用镍柱、离子交换柱、除盐柱纯化获得目的重组蛋白。
[0017]
优选的，所述步骤a)中在ph值为0.5～2的盐酸溶液中挤出成型；所述挤出的流速为10～150μl/min。
[0018]
优选的，所述含有edc/nhs交联剂的缓冲溶液为含有edc/nhs交联剂的mes缓冲溶液；反应时间为24～48小时。
[0019]
优选的，所述含有重组蛋白或者聚赖氨酸的缓冲溶液为含有重组蛋白或者聚赖氨酸的pbs缓冲溶液，重组蛋白或者聚赖氨酸的浓度为10～20mg/ml，反应时间为2～4小时。
[0020]
本发明提供如上文所述的重组蛋白复合纤维在组织缝合和细胞培养中的应用。
[0021]
优选的，将重组蛋白复合纤维缝合破损的组织，所述组织包括动物的小肠、肝、膀胱、皮肤、脾脏和肌肉中的一种或几种。
[0022]
优选的，将重组蛋白复合纤维作为贴壁细胞依附的支架培养细胞，所述细胞包括人源骨髓间充质干细胞或鼠源骨髓间充质干细胞。
[0023]
本发明提供一种重组蛋白复合纤维，由重组蛋白和纳米纤维素共价交联得到；所述重组蛋白为序列为mgagpgvg[(vpgkg)9vpgvg]
n-1
(vpgkg)9vpgwphhhhhh的elp重组蛋白，n为2、4、8或16；所述重组蛋白用于提高纳米纤维素的力学性能；所述纳米纤维素与重组蛋白的质量比为(5～50)：1；所述共价交联为先用edc/nhs处理，然后与重组蛋白或聚赖氨酸反应。
[0024]
本发明的有益效果如下：
[0025]
(1)利用富含赖氨酸的elp重组蛋白与纳米纤维素共价交联的方法提升纳米纤维素纤维的力学性能，尤其是韧性与延展性。
[0026]
(2)利用重组蛋白与纳米纤维素制备复合纤维，不仅具有优越的力学性能还具有良好的生物相容性。
[0027]
(3)通过后处理及加捻的单股复合纤维可以应用于组织缝合、细胞培养，拓展了复合纤维的应用范围。
附图说明
[0028]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0029]
图1为本发明实施例1中单纯纳米纤维素的拉伸测试曲线图；
[0030]
图2为本发明实施例1中经后处理的纳米纤维素/重组蛋白复合纤维的拉伸测试曲线图
[0031]
图3为本发明对比例1中经后处理后纳米纤维素/天然牛血清蛋白复合纤维的拉伸测试曲线图；
[0032]
图4为本发明实施例1～3的重组蛋白复合纳米纤维的力学性能；
[0033]
图5为本发明实施例5～7的重组蛋白复合纳米纤维的力学性能；
[0034]
图6为本发明实施例8～9的重组蛋白复合纳米纤维的力学性能；
[0035]
图7为本发明实施例10中单股纤维的皮肤缝合效果；
[0036]
图8为本发明实施例10中单股纤维的细胞培养状况。
具体实施方式
[0037]
本发明提供了一种重组蛋白复合纤维，由重组蛋白和纳米纤维素共价交联得到；
[0038]
所述重组蛋白为序列为mgagpgvg[(vpgkg)9vpgvg]
n-1
(vpgkg)9vpgwphhhhhh的elp重组蛋白，n为2、4、8或16；所述重组蛋白用于提高纳米纤维素的力学性能；
[0039]
当n＝2时，elp重组蛋白的序列为mgagpgvg(vpgkg)9vpgvg(vpgkg)9vpgwphhhhhh，如seq id no.1所示；
[0040]
当n＝4时，elp重组蛋白的序列为mgagpgvg[(vpgkg)9vpgvg]3(vpgkg)9vpgwphhhhhh，如seq id no.2所示；
[0041]
当n＝8时，elp重组蛋白的序列为mgagpgvg[(vpgkg)9vpgvg]7(vpgkg)9vpgwphhhhhh，如seq id no.3所示；
[0042]
当n＝16时，elp重组蛋白的序列为mgagpgvg[(vpgkg)9vpgvg]
15
(vpgkg)9vpgwphhhhhh，如seq id no.4所示；
[0043]
所述纳米纤维素与重组蛋白的质量比为(5～50)：1；
[0044]
所述共价交联为先用edc/nhs处理，然后与重组蛋白或者聚赖氨酸反应。
[0045]
在本发明中所使用的序列为mgagpgvg[(vpgkg)9vpgvg]
n-1
(vpgkg)9vpgwphhhhhh的elp重组蛋白(k18、k36、k72、k144)工程菌由实验室自主构建，培养k
18
、k
36
、k
72
、k
144
工程菌并诱导其表达目的蛋白。利用镍柱、离子交换柱、除盐柱除去杂质蛋白后冻干获得纯度较高的重组蛋白。具体的，可使用“engineered near-infrared fluorescent protein assemblies for robust bioimaging and therapeutic applications[j].advanced materials,2020,32(17).”或者“ultra-strong bio-glue from genetically engineered polypeptides[j].nature communications,2021,12(1).”中的k
18
、k
36
、k
72
、k
144
工程菌。
[0046]
在本发明中，所述纳米纤维素优选为tempo氧化法处理纤维素木浆后利用机械法制备得到的纳米纤维素；所述纳米纤维素的浓度为5～20mg/ml，优选为10～15mg/ml。
[0047]
在本发明中，所述纳米纤维素与重组蛋白的质量比(干重)优选为(5～50)：1，更优选为(10～40)：1，如5：1、10：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1、50：1，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
[0048]
本发明还提供了一种重组蛋白复合纤维的制备方法，即利用重组蛋白提升纳米纤维素纤维力学性能的方法，具体如下：
[0049]
首先进行重组蛋白的表达和纯化和纳米纤维素的制备
[0050]
1)重组蛋白的表达和纯化
[0051]
用lb培养液培养k
18
、k
36
、k
72
或k
144
工程菌7～8小时，当菌液od值达3～4后转移至tb培养液中，待od值达0.6～0.8时用iptg诱导细菌表达目的蛋白，诱导后培养10～12小时。5000～6000rpm离心15分钟，弃去上清液，保留沉淀。利用不含咪唑的镍缓冲液重悬菌体并加入终浓度为5～6μg/mldna酶、1～2mg/ml溶菌酶、20～30mmol/lmgcl2，重悬后的菌液用高压破碎机破碎菌体，之后10000～11000rpm离心30～40分钟。收取上清液并抽滤去除固体杂
质待用。
[0052]
然后依次使用镍亲和层析柱、阳离子交换柱和除盐柱进行纯化，纯化后得到的目的蛋白冻干待用。
[0053]
2)纳米纤维素的制备
[0054]
本发明利用tempo氧化法处理纤维素木浆后利用机械法制备纳米纤维素。具体如下：
[0055]
将木浆加超纯水搅拌过夜，然后加入tempo(2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物)和nabr的水溶液，与木浆混匀，使用naoh将混匀的溶液ph调整为10左右，逐滴加入naclo，进行反应，反应结束后加入乙醇进行沉淀，然后离心，将沉淀水洗，最后用超纯水混匀并用机械法处理获得纳米纤维素。
[0056]
在本发明中，所述木浆优选为桦木、杉树或者松树木浆，所述tempo与nabr的质量比为(1～10)：25，更优选为(3～8)：25，最优选为4:25；所述naoh的浓度优选为0.1～1.0mol/l，更优选为0.3～0.8mol/l，最优选为0.5～0.6mol/l。
[0057]
本发明优选在半小时内，逐滴加入naclo，所述naclo的用量关系优选为5～15mmol/g木浆，更优选为10mmol/g木浆。加入naclo后，反应2～5小时，优选为3～4小时，在反应过程中优选保持ph为10.5。
[0058]
在本发明中，所述机械法处理获得纳米纤维素具体为用高压均质机在1000bar下进行机械处理10min。。
[0059]
在本发明中，按照上述方法获得的纳米纤维素为胶体状态，所述纳米纤维素的浓度优选为5～20mg/ml，优选为10～15mg/ml。
[0060]
得到重组蛋白和纳米纤维素之后，本发明将二者混合，然后将混合后的溶液在酸溶液中挤出成型，并利用收集器收集、干燥，得到成型的纤维。
[0061]
在本发明中，所述纳米纤维素和重组蛋白的质量比优选为(5～50)：1，更优选为(10～40)：1，如5：1、10：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1、50：1，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
[0062]
在本发明中，所述酸溶液优选为盐酸溶液，所述酸溶液的ph值优选为0.5～2，更优选为0.5～1，本发明优选能使用带有注射泵的注射器进行上述挤出，所述挤出的流速优选为10～150μl/min，更优选为30～120μl/min，最优选为50～100μl/min，具体的，可以是10μl/min，20μl/min，30μl/min，40μl/min，50μl/min，60μl/min，70μl/min，80μl/min，90μl/min，100μl/min，110μl/min，120μl/min，130μl/min，140μl/min，150μl/min，160μl/min，170μl/min，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
[0063]
本发明将收集到的成型纤维进行干燥，所述干燥的温度优选为20～25℃；所述干燥的时间优选为0.5～2小时，更优选为1～1.5小时。
[0064]
本发明将干燥的成型纤维首先用edc/nhs处理以活化纳米纤维素的羧基，然后进一步与聚赖氨酸的氨基或者重组蛋白的氨基反应形成酰胺键，其中重组蛋白为更优选。具体步骤如下：
[0065]
将成型纤维浸泡在溶解有edc/nhs的mes缓冲溶液中，进行活化，在本发明中，所述edc与nhs的摩尔比优选为(2～5)：1，更优选为(3～4)：1；所述edc与nhs与纳米纤维素的质量比优选为(320～80)：(48～12)：1，更优选为(100～80)：(15～12)：1；mes缓冲溶液ph为6，
反应时间为24～48小时，反应温度优选为20～25℃。
[0066]
然后将活化后的纤维转移至含有重组蛋白或者聚赖氨酸的pbs缓冲液中，进行酰胺化反应。
[0067]
在本发明中，所述重组蛋白或者聚赖氨酸的pbs缓冲液中，重组蛋白或者聚赖氨酸的浓度优选为10～20mg/ml，更优选为13～15mg/ml，所述pbs缓冲液的ph值优选为7.2～7.4；所述反应的温度优选为20～25℃；所述反应的时间优选为2～4小时。
[0068]
最后，将复合纤维在超纯水中静置2～5小时，干燥后得到重组蛋白复合纤维。
[0069]
上述方案制备得到的为单根的重组蛋白复合纤维，可作为贴壁细胞依附的支架用于细胞培养，也可将多根(如10～35根)上述重组蛋白复合纤维在盐酸溶液中成型后进行汇集，酰胺化反应后形成单股的重组蛋白复合纤维，干燥后可用于破损组织的缝合。
[0070]
基于此，本发明还提供了重组蛋白复合纤维在组织缝合和细胞培养中的应用。
[0071]
在本发明中，所述组织包括动物的小肠、肝、膀胱、皮肤、脾脏和肌肉中的一种或几种。
[0072]
所述细胞包括人源骨髓间充质干细胞或鼠源骨髓间充质干细胞。
[0073]
本发明提供一种重组蛋白复合纤维，由重组蛋白和纳米纤维素共价交联得到；所述重组蛋白为序列为mgagpgvg[(vpgkg)9vpgvg]
n-1
(vpgkg)9vpgwphhhhhh的elp重组蛋白，n的取值范围为2，4，8或16；所述重组蛋白用于提高纳米纤维素的力学性能；所述纳米纤维素与重组蛋白的质量比为(5～50)：1；所述共价交联为先用edc/nhs处理，然后与重组蛋白或者聚赖氨酸反应。
[0074]
本发明的有益效果如下：
[0075]
(1)利用富含赖氨酸的elp重组蛋白与纳米纤维素共价交联的方法提升纳米纤维素纤维的力学性能，尤其是韧性与延展性。
[0076]
(2)利用重组蛋白与纳米纤维素制备复合纤维，不仅具有优越的力学性能还具有良好的生物相容性。
[0077]
(3)通过后处理及加捻的单股复合纤维可以应用于组织缝合、细胞培养，拓展了复合纤维的应用范围。
[0078]
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种重组蛋白复合纤维、其制备方法及应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
[0079]
实施例1
[0080]
纳米纤维素的制备
[0081]
称取1g桦木、杉树或者松树木浆用60ml超纯水搅拌过夜。称取16mgtempo、100mgnabr用40ml超纯水溶解，将溶解后的溶液与木浆混匀。用0.5mol/l的naoh将木浆ph调整为10。在半小时内用注射器逐滴加入naclo7.5ml，反应3h并保持ph为10.5。之后加入300ml乙醇沉淀，6000rpm离心15分钟，留沉淀。用去离子水清洗并离心3遍。最后用超纯水混匀并用机械法处理获得纳米纤维素。取1ml纳米纤维素冻干，称量冻干后的质量确定浓度。浓度范围为5-20mg/ml。
[0082]
用移液枪取1ml浓度为10mg/ml的纳米纤维素。用1ml注射器注射纳米纤维素溶液到ph为0.5的盐酸溶液中成型。注射泵流速为80μl/min。
[0083]
挑起成型后的纤维并利用收集器收集纤维，纳米纤维素纤维在室温下干燥2小时。
[0084]
随机选取3根纳米纤维素纤维进行力学拉伸测试。力学拉伸测试结果如图1所示。单纯纳米纤维素纤维的强度在300～400mpa之间，延展性在3％～6％之间，韧性为9～14mj/m3。
[0085]
重组蛋白的表达和纯化
[0086]
用100mllb培养液培养由实验室构建的k
144
工程菌7-8小时，当菌液od值达3-4后转移至1ltb培养液中，待od值达0.6-0.8时用iptg诱导细菌表达目的蛋白，诱导后培养10～12小时。6000rpm离心15分钟，弃去上清液，保留沉淀。利用不含咪唑的镍缓冲液重悬菌体并加入终浓度为5μg/mldna酶、1mg/ml溶菌酶、30mmol/lmgcl2，重悬后的菌液用高压破碎机破碎菌体，之后11000rpm离心30分钟。收取上清液并抽滤去除固体杂质待用。配置镍lysis缓冲液与镍elusion缓冲液。利用纯化仪进行蛋白纯化，首先安装镍亲和层析柱并清洗系统，用lysis缓冲液平衡镍柱，待uv280平稳后上样，流速为10-20ml/min。上样后继续用lysis缓冲液平衡直至uv280值稳定。线性洗脱样品，当uv280起峰时收集样品直至吸收峰收集完成，流速为10-20ml/min，收集时间为30-50min。利用相同的方法依次利用阳离子交换柱与除盐柱进行纯化，其中除盐柱无需配置缓冲液，用超纯水即可。纯化后得到目的蛋白冻干待用。
[0087]
重组蛋白复合纳米纤维的制备
[0088]
(1)用移液枪取1ml浓度为10mg/ml的纳米纤维素加入离心管中，称量10mg重组蛋白，用2ml超纯水溶解，重组蛋白浓度为5mg/ml，取200μl重组蛋白溶液与纳米纤维素混匀。其中纤维素与重组蛋白比例是10:1
[0089]
(2)混合后的溶液用1ml注射器在注射泵的推动下注入ph为0.5的盐酸溶液中成型并用收集器收集，流速为80μl/min。纤维室温干燥2小时。
[0090]
(3)称取mes4.265g，nacl5.844g溶解于200ml超纯水中，并将缓冲液ph调整为6。称取edc800mg，nhs120mg，(摩尔比edc：nhs＝4：1)将edc、nhs溶解在40ml配置好的mes缓冲液中。将干燥后的复合纤维放入含edc/nhs的mes缓冲液中反应24小时。
[0091]
(4)称量kh2po40.24g、nahpo41.44g、nacl8g、kcl0.2g溶解于1l超纯水中，ph调整为7.4。称取40mg重组蛋白溶解在30mlpbs缓冲溶液中。将与edc/nhs活化后的复合纤维转移到含重组蛋白的pbs缓冲液中，酰胺化反应2小时。
[0092]
(5)之后将复合纤维转移到40ml超纯水中，静置3小时。
[0093]
(6)将复合纤维从超纯水中取出，室温干燥2小时。
[0094]
随机选取3根干燥后的复合纤维进行力学拉伸测试。力学拉伸测试图如附图2所示。结果表明复合纤维的力学性能得到全面且明显的提升。强度达400～600mpa，韧性达30～40mj/m3，延展性为8％～13％。
[0095]
对比例1
[0096]
按照实施例1中的方法制备得到重组蛋白复合纳米纤维，不同的是，将实施例1中的重组蛋白替换为天然牛血清蛋白。
[0097]
纳米纤维素/天然牛血清蛋白复合纤维力学拉伸测试图如图3，由图2和图3对比可知，纳米纤维素/重组蛋白的力学性能显著高于单纯纳米纤维素及纳米纤维素/天然牛血清蛋白复合纤维。
[0098]
实施例2～3
[0099]
按照实施例1中的方法制备得到重组蛋白复合纳米纤维，不同的是，实施例2中
edc：nhs＝8：1(摩尔比)，实施例3中edc：nhs＝16：1(摩尔比).
[0100]
实施例1～3的纤维力学性能如图4所示，由图4可知，干燥后用多个不同比例edc/nhs对复合纤维进行后处理，可见edc与nhs比例高于4:1对纤维力学性能的提升并不明显。
[0101]
实施例4～7
[0102]
按照实施例1中的方法制备得到重组蛋白复合纳米纤维，不同的是，实施例4中将干燥后的复合纤维放入含edc/nhs的mes缓冲液中反应2小时；
[0103]
实施例5中将干燥后的复合纤维放入含edc/nhs的mes缓冲液中反应12小时；
[0104]
实施例6中将干燥后的复合纤维放入含edc/nhs的mes缓冲液中反应24小时；
[0105]
实施例7中将干燥后的复合纤维放入含edc/nhs的mes缓冲液中反应48小时；
[0106]
力学性能比较如图5所示。结果显示在24小时内复合纤维力学性能随着后处理时间延长得到一定提升，但是当超过24小时，后处理时间进一步延长反而降低了复合纤维的力学性能。
[0107]
实施例8～9
[0108]
按照实施例1中的方法制备得到重组蛋白复合纳米纤维，不同的是，实施例8中聚赖氨酸的用量为80mg，实施例9中聚赖氨酸的用量为160mg。
[0109]
力学性能的比较如图6所示。可以看到聚赖氨酸的含量提升对力学性能的提升没有显著影响。
[0110]
实施例10
[0111]
按照实施例1中的方法制备得到单根复合纤维，在步骤(2)中复合纤维未干燥之前将20根复合纤维重复收集在一处形成单股纤维。单股纤维干燥2小时。
[0112]
干燥后的单股纤维按照实施例1中的步骤(3)～(6)进行交联后处理。
[0113]
将制备好的单股纤维两端修剪平齐制备缝线，该缝线表面光滑。
[0114]
利用实验猪制备皮肤破损模型，利用制备的缝线缝合皮肤破损处。实物图如附图7所示。
[0115]
用dmem培养液培养人源间充质干细胞，待细胞长满培养瓶80％左右用胰蛋白酶消化细胞2分钟，转移到含单股复合纤维的1ml培养皿中，加入dmem培养液共培养24小时。
[0116]
通过共聚焦显微镜观察人源间充质干细胞在复合纤维上的生长情况。具体如附图8所示。
[0117]
通过上述实施例可知，通过与elp重组蛋白共价交联后复合纤维的力学性能较单纯纳米纤维素纤维的力学性能有了全面且明显的提升。此外由于复合纤维具有较好的生物相容性还能应用于组织损伤缝合以及细胞培养，拓展了复合纤维的应用范围。
[0118]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。