1.本发明属于生物技术领域，涉及细胞技术领域，具体涉及一种猪卵巢颗粒细胞的分离及培养方法。
背景技术：
2.卵泡的发育与卵泡中颗粒细胞的增殖息息相关，大量研究表明，卵泡中颗粒细胞的异常凋亡会导致卵泡发育受阻。同时，在生猪生产中母猪的产子数与卵泡的正常排出及发育状况息息相关，并且在母猪的卵巢中只有不到1％的卵泡正常发育最终受精发育成胚胎，更多的则是直接闭锁没有发育。因此探究卵巢颗粒细胞的增殖可以在抑制卵巢颗粒细胞凋亡中奠定理论基础。探究卵巢颗粒细胞的分离与培养可以促进卵巢颗粒细胞增殖、凋亡相关研究的实验进展、效率。
3.中国专利cn112852712a提供了一种猪卵巢gv期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法，其主要目的是解决细胞贴壁、一致性问题和污染问题。虽然其声称具有较高的存活率，但经验证其存活率不足85％。
4.中国专利cn106701659a提供了一种猪卵巢颗粒细胞原代培养的方法，该方法虽然具有污染底、分离效率高、颗粒细胞纯净的优点，但其同样存在存活率低的问题。经验证，其存活率不足76％。
5.因此，本领域亟需一种新型卵巢颗粒细胞分离及培养方法，可以提高分离下来的卵巢颗粒细胞贴壁及存活率。
技术实现要素：
6.针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高分离效率、促进细胞贴壁、细胞存活率高的猪卵巢颗粒细胞的分离及培养方法。
7.为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
8.1)将母猪的卵巢在生理盐水中浸泡，利用含抗生素的pbs溶液清洗：
9.2)吸出透亮卵泡的卵泡液，并利用含抗生素的pbs溶液，稀释卵泡液并过筛，离心去除上清液，收集沉淀后用含抗生素以及fbs的培养液培养卵巢颗粒细胞；
10.3)剔除卵巢表面包膜、周围的结缔组织和脂肪杂组织块，用pbs溶液清洗干净，从卵泡中释放卵泡液，并将卵巢组织剪碎成肉糜状；向剪碎的卵巢组织加入胰蛋白酶进行消化，之后加入fbs培养基终止消化，离心并取沉淀，用fbs培养液培养；
11.4)步骤2)和/或步骤3)培养所得细胞贴壁后，适时更换新的20％fbs培养液，去掉血细胞以及个别杂质；培养至密度至80％后，进行消化或传代冻存处理；
12.在上述步骤中，所述抗生素为青霉素、链霉素和两性霉素的混合物。
13.作为本发明一个可选的实施方案，步骤1)中，浸泡温度为38
±
1℃，浸泡时间为1小时；清洗时，清洗溶液的温度为37℃，清洗次数为3次。
14.作为本发明一个可选的实施方案，在进行所述离心时，离心转速为800rpm。
15.作为本发明的优选实施方案，所述抗生素中，青霉素、链霉素和两性霉素的重量比为2:2:1。
16.作为本发明的优选实施方案，步骤1)中，含抗生素的pbs溶液中，抗生素的重量含量为3％。
17.作为本发明的优选实施方案，步骤2)中，所述含抗生素的pbs溶液中，抗生素的重量含量为1％；所述含抗生素以及fbs的培养液中，抗生素的重量含量为1％；进行培养时，培养温度为38.6℃。
18.作为本发明的优选实施方案，步骤3)中，进行所述消化时，消化温度为37℃；终止消化时，fbs培养基中fbs的重量含量为10％；进行培养时，所用fbs培养基中fbs的重量含量为20％。
19.作为本发明一个可选的实施方案，步骤4)中，所述传代冻存操作中，传代方式为：待卵巢颗粒细胞增殖到85％后弃掉原培养基，用pbs清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37℃细胞培养箱，2分钟后，加入新鲜培养基终止消化；之后将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管，最终将细胞用培养液冲匀接种到细胞瓶中。
20.本发明的有益效果：
21.本发明可以快速实现卵巢颗粒细胞分离，快速贴壁，并可获得97％以上的细胞存活率。
附图说明
22.图1为经由卵巢组织消化而得卵巢颗粒细胞贴壁7小时后光镜图(40x)；
23.图2为经由卵泡液而得卵巢颗粒细胞贴壁7小时后光镜图(40x)；
24.图3为经由卵泡液而得卵巢颗粒细胞贴壁36小时后光镜图(40x)；
25.图4为经由卵泡液而得卵巢颗粒细胞贴壁36小时后光镜图(100x)。
具体实施方式
26.下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
27.实施例1
28.本实施例中，所用抗生素为三抗，即青霉素、链霉素和两性霉素按照重量比2:2:1的比例混合而得的混合物。“n％三抗”表示所用三抗中抗生素的重量含量为n％，“n％fbs”表示含有重量分数n％的fbs。
29.本实施例中，pbs为磷酸盐缓冲盐液，fbs为胎牛血清。
30.1.卵巢的前处理
31.将母猪的卵巢在38℃
±
1℃度生理盐水中浸泡，于1小时后取用，用含3％三抗的pbs(37℃下)清洗3次。
32.2.卵泡液的收集
33.用1ml注射器，逐个吸出透亮卵泡的卵泡液，并用含1％三抗的pbs稀释卵泡液并过筛(200目)，过筛后将稀释后卵泡液离心(转速为800rpm)，去除上清液，重复过筛离心步骤，
之后收集沉淀并用含有1％三抗以及20％fbs培养卵巢颗粒细胞，置于38.6摄氏度培养箱培养。
34.3.卵巢组织的处理
35.在无菌条件下，用剪刀以及镊子在培养皿(灭菌)中剔除卵巢表面包膜、周围的结缔组织和脂肪杂组织块。用pbs清洗干净后，将卵泡用手术刀划破释放剩余卵泡液，并用小剪刀将卵巢组织剪碎成肉糜状，向肉糜中加入3～4倍体积的胰蛋白酶溶液，于37℃水浴消化1小时，观察组织消化的状态。加入10％fbs培养基终止消化，而后离心8分钟(转速800rpm)，去掉上层有血丝的浑浊液，保留沉淀，过筛200目，用pbs冲匀后离心(转速800rpm)5分钟，去除上清，重复此操作一次后，将沉淀用20％fbs培养基冲匀后置于38.6℃培养箱培养细胞。
36.4.细胞培养过程
37.待细胞贴壁2小时后，将细胞培养液更换成新鲜培养液，去掉血细胞以及个别杂质。贴壁后，每天更换培养液，待密度长到80％左右，开始消化，并对部分进行传代冻存。
38.传代方式：待卵巢颗粒细胞增殖到85％后弃掉原培养基，用pbs清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37℃细胞培养箱，2分钟后，加入新鲜培养基终止消化；之后将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管，最终将细胞用培养液冲匀接种到细胞瓶中。
39.对上述实验进行5次重复，对由卵泡液和卵巢组织消化获得的卵巢颗粒细胞的贴壁情况进行观察，并检测计算细胞存活率。贴壁情况如图1～4所示。可见，无论是由卵泡液和卵巢组织消化获得的卵巢颗粒细胞的贴壁效果均非常好，也可知细胞的存活生长情况非常好。经对5次重复实验的细胞存活率进行考察，平均存活率为98.1％，同时最低的存活率为97.7％。