1.本发明属于家畜遗传标记筛选技术领域，具体涉及一种猪肌内脂肪含量性状的遗传标记及应用。
背景技术：
2.随着社会经济发展和人民生活水平的提高，高品质、多元化、个性化消费需求的优质猪肉市场需求激增，但是当前综合性状优良、特色鲜明、满足中国人口味的猪肉产品不多，猪肉产品市场供需不匹配问题逐渐显现，因此，猪肉品质遗传改良已越来越被重视。肌内脂肪含量(intramuscular fat,imf)是影响肉品质性状的一项重要指标，它与猪肉的嫩度、风味、多汁性存在显著相关(lu etal.2008)。然而，猪肉质性状较难活体测量，很难用常规育种技术进行遗传改良，因此寻找控制猪肉质性状(尤其是imf)的关键分子遗传标记，应用于该性状的分子辅助育种，对提高猪肉品质性能具有重要意义。
3.eepd1(endonuclease/exonuclease/phosphatase family domain containing 1)编码核酸内切酶/核酸外切酶/磷酸酶家族结构域包含蛋白1，主要在人类dna损伤过程中修复应激复制叉中起作用(kim etal.,2017)。ji等(2012)在对鸡脂肪组织的转录组分析也发现，鸡eepd1基因表达量的降低与禁食和胰岛素中和能力均相关，表明其对脂肪酸合成具有负调控作用。li等(2020)利用高通量转录组测序技术发现eepd1基因在荷斯坦公牛和阉公牛的腰最长肌中差异表达，且牛eepd1基因与牛肉品质性状相关。而有关猪eepd1基因对肉质性状的影响还未见报道。
4.申请人前期利用rna-seq技术对比分析了imf极端个体背最长肌组织基因表达差异，发现eepd1基因显著差异表达。因此，申请人扩增了猪eepd1基因的部分核苷酸序列，利用该序列进行了多态性变异位点的筛选鉴定及与imf性状的关联分析研究，以期获得与猪imf性状相关的新分子标记。
技术实现要素：
5.本发明的技术目的在于扩增猪eepd1基因的第二外显子dna序列，以寻找该基因序列突变位点多态性，获得一种与猪肌内脂肪含量性状相关的遗传标记，并利用该遗传标记作为猪标记辅助选择中。
6.为实现上述技术目的，本发明提供了一种猪肌内脂肪含量性状的遗传标记，它是猪eepd1基因第二外显子的部分dna序列，其核苷酸序列如seq id no：1和seq id no：2所示，在该序列的第796bp处存在一个c》t碱基突变。
7.本发明还提供了所述遗传标记在猪肌内脂肪含量性状标记辅助选择中的应用。
8.优选地，所述的应用是所制备的遗传变异标记在猪imf性状的关联分析中的应用。
9.本发明的有益效果是：本发明为猪肌内脂肪含量性状的分子标记辅助育种提供了一个新的遗传标记。
附图说明
10.图1是本发明的总体技术流程图；
11.图2是本发明中猪eepd1基因第二外显子pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
12.图3是本发明中猪eepd1基因第二外显子g.1876c》t突变位点seq id no：4引物反向测序的测序图谱；
13.图4是猪eepd1基因第二外显子片段核苷酸序列直观图(与seq id no：1和seq id no：2所示的序列表相对应)。
具体实施方式
14.下面结合附图1-4，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
15.如未特别说明，以下实施例中所采用的方法和参数均为本领域常规的方法和参数。
16.需要说明的是：
17.序列表seq id no：1是扩增的一个“硒都黑猪”eepd1基因第二外显子的核苷酸序列，序列长度为978bp。在该序列第796碱基处存在一个c》t碱基的替换(在序列表seq id no：1中显示的结果是已经替换的碱基)；
18.序列表seq id no：2是扩增的一个“硒都黑猪”eepd1基因第二外显子的核苷酸序列，序列长度为978bp，在该序列第796碱基处存在一个t》c碱基的替换(在序列表seq id no：2中显示的结果是已经替换的碱基)；
19.序列表seq id no：3是扩增seq id no：1和seq id no：2特异基因片段所用的正向引物序列；
20.序列表seq id no：4是扩增seq id no：1和seq id no：2特异基因片段所用的反向引物序列；
21.图2中泳道m是100bpdna ladder，泳道1、2是扩增的seq id no：1和seq id no：2特异基因片段；
22.图4中加粗带框字母代表存在突变处，突变位置分为位于该序列的第796碱基处，带下划线序列代表引物位置。
23.本发明通过以下技术方案实现：
24.本发明获得了一种猪肌内脂肪含量性状的遗传标记，它是猪eepd1基因第二外显子的部分dna片段，其核苷酸序列如序列表seq id no：1(长度为978bp)和seq id no：2(长度为978bp)所示。在seq id no：1和seq id no：2第796碱基处存在一个c》t碱基突变(如图3所示)。
25.申请人提供了一种扩增猪eepd1基因第二外显子部分dna片段的引物对，该引物对的dna序列如seq id no：3和seq id no：4所示。
26.申请人提供了一种制备猪肌内脂肪含量性状相关基因eepd1遗传标记的方法，其步骤如下：
27.参考genbank数据库中猪eepd1基因(登录号nc_010460.4)的dna序列第二外显子设计特异引物(该引物的序列如序列表seq id no：3和seq id no：4所示)，以硒都黑猪基因组dna混合池为模板进行pcr扩增，对pcr产物回收并进行dna测序分析，得到如序列表seq id no：1和seq id no：2所示的基因片段。根据测序结果筛查dna序列变异，在796bp处存在一个c》t碱基突变(即等位基因突变)所述的遗传标记如图3所示，利用该遗传标记在对硒都黑猪群中基因型与肌内脂肪含量性状进行了关联分析检测。
28.本发明为猪肌内脂肪含量性状的分子标记辅助育种提供了一个新的遗传标记。
29.更详细技术细节如下列实施例所述。
30.实施例1猪eepd1基因片段的获得及多态性检测方法的建立
31.1.猪基因组dna的提取
32.本发明的试验猪品种为硒都黑猪，样本来源于湖北天之力优质猪育种有限公司。硒都黑猪是以恩施黑猪、梅山猪、湖北白猪等为基础，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北天之力优质猪育种有限公司等单位历经12年培育而成的黑猪新品种。猪基因组dna的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组dna试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：
33.(1)采取猪背最长肌组织，放入2ml的离心管中，加入200μl裂解液tl，用枪头吹打均匀；
34.(2)加入20μl蛋白酶k(20mg/ml)，剧烈颠倒充分混匀，55℃水浴锅中消化过夜；
35.(3)加入200μl结合液cb(试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10min；
36.(4)冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒充分混匀；
37.(5)用1ml的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱ac中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；
38.(6)加入500μl抑制物去除液ir(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，弃废液；
39.(7)加入700μl漂洗液wb(试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液；
40.(8)重复操作步骤7；
41.(9)将吸附柱ac放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应；
42.(10)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液eb(该试剂盒自带)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中；
43.(11)对提取出的dna的浓度及质量进行检测后置于-20℃下保存备用。
44.剩下肌肉样本封袋保存于干冰中，送至华中农业大学农业部种猪质量监督检验测试中心(武汉)用于imf的测定。
45.2.猪eepd1基因第二外显子片段的获得
46.(1)pcr扩增
47.根据猪eepd1基因的基因组序列(genbank登陆号：nc_010460.4)设计以下引物对：
48.正向引物eepd1-e2-f：5'ttcgtgccctgactccttc 3'，
49.反向引物eepd1-e2-r：5'gggttgttggccttctcc 3'。
50.利用上述引物在37个硒都黑猪混合基因组dna池中进行pcr扩增，pcr反应体系50μ
l，体系中各组分的浓度为100ng模板dna、10
×
buffer(含mg2+)4μl、上述上下游引物各0.5μm、2.5μm dntps、1u taqdna聚合酶。
51.pcr的运行程序为：95℃预热2min；94℃变性20s，57℃退火40s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
52.(2)pcr产物纯化
53.上述pcr产物用上海生工生物工程有限公司的gel extraction kit试剂盒进行纯化(按照该试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管，加入400μl溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时dna被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μl洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5ml离心管中，加入40μl洗脱液或双蒸水(ph》7.0)，室温或37℃放置2-3min；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的dna片段。
54.3.猪eepd1基因第二外显子片段变异位点的获得
55.将上述回收获得的dna片段送到武汉奥科鼎盛生物科技有限公司采用abi3730xl测序仪测序，发现了1个单碱基突变位点(图3)，位于eepd1基因组核苷酸序列(即全序列)(genbank nc_010460.4)的第1876p处的c》t突变(对应于本发明的eepd1基因第二外显子片段的突变位点分别是：在seq id no：1是796bp处存在一个c》t碱基突变(即等位基因突变)；在seq id no：2是796bp处存在一个t》c碱基突变(即等位基因突变)。
56.4.分子标记基因分型
57.将待检测个体的dna样本作为模板，按照以上步骤2所述方法进行猪eepd1基因第二外显子序列片段的扩增，将获得的pcr纯化产物直接送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，直接从测序结果中读取基因分型结果。
58.实施例2本发明制备的遗传变异标记在猪imf性状的关联分析中的应用
59.申请人在256头硒都黑猪群(来自湖北天之力优质猪育种有限公司)检测本发明制备的两个分子遗传标记与猪imf性状的关联性。
60.采用实施例1建立的pcr直接测序方法来进行基因分型检测，采用spss统计软件(statistical package for the social sciences,version 17.0)一般线性模型glm进行统计分析。所采用模型为：y
ijklm
＝μ+gi+aj+xk+s
l
+e
ijklm
，其中：y
ijklm
表示imf值；μ表示群体均值；gi表示基因型效应；aj表示年季效应；xk表示性别效应；s
l
表示父本效应；e
ijklm
表示随机残差效应。结果以最小二乘均值
±
标准误表示，p《0.05判定为差异显著；p《0.01判定为差异极显著。
61.关联分析结果如表1所示，发现g.1876c》t极显著影响imf性状(p《0.01)。携带tt基因型个体的imf极显著高于ct和cc基因型个体(p《0.01)，ct基因型个体显著高于cc基因型个体(p《0.05)，imf存在tt》ct》cc的趋势，t位点是imf性状的一个优势等位基因。在育种中应优先保留携带tt基因型的个体，有利于提高群体的肌内脂肪含量性状。
62.表1猪eepd1基因第二外显子g.1876c》t与imf性状关联分析结果
[0063][0064]
表1注：肩标不同小写字母表示同一行的数据之间差异显著，p《0.05；不同大写字母表示同一行的数据之间差异极显著，p《0.01。