鉴别百日草舌状花平瓣性状和管瓣性状的共显性indel分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子标记领域，具体涉及一种鉴别百日草舌状花平瓣性状和管瓣性状的共显性indel分子标记及其应用。
背景技术：
2.百日草由于其花期较长、花色丰富，是重要的花坛、花境以及盆花、切花材料，具有重要的商业价值。百日草的头状花序是观赏的主要部分，直接关系到感官品质。自然界中大多数菊科植物的头状花序由平瓣舌状花和管瓣筒状花组成，花瓣形状对研究植物-传粉者的相互作用有非常重要的意义。百日草自然产生的管瓣舌状花不仅丰富了菊科植物的头状花序类型，并且为研究花瓣形状提供了良好材料。
3.研究发现，花瓣的形状与花对称性有关，因此与花对称性相关的基因可作为花瓣管瓣化的候选基因。然而目前对百日草舌状花管瓣性状共分离分子标记的开发进展缓慢，主要原因是由于基因组信息的缺乏，分子标记离管瓣位点比较远，难以有效利用开发共分离的分子标记。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鉴别百日草舌状花平瓣性状和管瓣性状的共显性indel分子标记及其应用。
5.为实现上述目的，本发明所设计一种鉴别百日草舌状花平瓣性状和管瓣性状的共显性indel分子标记，所述共显性indel分子标记分别如其核苷酸序列如seq id no:2和seq id no:3所示。
6.本发明还提供一种用于获得上述分子标记的引物对，所述述引物对indel f/r为：
7.正向引物indel f：5
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aaaacccttgattggttgttcac
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3，
8.反向引物indel r：5
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atggctttggaggcttttctt
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3。
9.本发明还提供一种上述分子标记在百日草舌状花瓣型相关分子标记辅助育种中的应用。
10.本发明还提供一种上述引物对在百日草舌状花瓣型相关分子标记辅助育种中的应用。
11.本发明还提供一种鉴定百日草瓣型分离群体基因型的试剂盒，所述试剂盒含有上述引物对indel f/r。
12.利用上述试剂盒鉴别百日草舌状花的瓣型性状和分离群体基因型的方法，包括以下步骤：
13.1)提取待检测百日草样品的基因组dna
14.2)以待检测的百日草基因组dna为模板，采用以下引物对：
15.正向引物indel f：5
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3，
16.反向引物indel r：5
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3；
17.进行pcr扩增，得到pcr产物；
18.3)检测pcr产物：
19.pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，记录基因型，在紫外灯下拍照；
20.若电泳条带中含有2596bp的条带时(seq id no:2所示)，该待检测百日草头状花序的舌状花瓣型为管瓣，该待测百日草为纯合管瓣；
21.或，若电泳条带中含有442bp的条带时(seq id no:3所示)，该待检测百日草头状花序的舌状花瓣型为平瓣，该待测百日草为纯合平瓣；
22.或，若电泳条带中同时含有442bp和2596bp的两条条带时，该待检测百日草头状花序的舌状花瓣型为平瓣；该待测百日草为杂合平瓣。
23.进一步地，其特征在于：所述步骤2)中，pcr反应体系：
24.待测百日草基因组dna0.5ul正向引物(0.2nmol/ul)0.5ul反向引物(0.2nmol/ul)0.5ulpcr mix5ul加入去离子水至10ul
25.pcr反应条件为：94℃预变性2min后，循环30次94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s；最后72℃延伸2min。
26.本发明的原理：
27.1.遗传标记作为生物个体或群体间遗传差异的客观表现，主要是指那些可明确反映生物多态性的生物特征。随着生物技术的迅猛发展，遗传标记的种类的到了迅速的发展和丰富，先后出现了形态标记、细胞学标记、蛋白质标记以及dna标记。dna标记与其他标记技术相比，具有数量丰富、多态性高、受环境条件和发育阶段影响小、检测手段简单、迅速等优点。因此，dna标记作为一种理想的分子标记，已广泛应用于动植物的分子生物学研究，在基因定位与克隆、物种起源以及驯化方面的研究中发挥着越来越重要的作用。近年来，随着高通量测序技术的发展，分子标记开发技术也得到迅猛地发展。利用高通量技术开发基于pcr技术、操作简单、应用价值大的分子标记，可为控制百日草重要园艺性状的基因定位和分子辅助选择育种奠定基础。
28.2.本发明中，百日草的头状花序是观赏的主要部分，头状花序由外围舌状花和内轮筒状花组成，本发明用于鉴定外围的舌状花瓣型，其中平瓣舌状花为显性性状，管瓣舌状花为隐性性状，与平瓣亲本s5相比，在管瓣亲本a1gh中所获得的分子标记中多一段2154bp的序列如seq id no.1所示，导致序列长度多态性，该片段插入位于编码区，导致氨基酸序列提前终止编码；故在cyc基因序列中多出一段2154bp的序列两侧设计引物，以待检测样品dna为模板进行pcr，从而鉴定百日草头状花序的舌状花瓣型性状。
29.3.鉴别百日草头状花序的舌状花瓣瓣型性状的共显性indel分子标记筛选原理：
30.1)通过构建舌状花瓣型分离群体筛选交换单株，以转录组数据为参考，筛选可能与瓣型相关的基因，以纯合平瓣(s5)的基因组和纯合管瓣(a1gh)的基因组为模板进行扩增，发现一个序列多态性基因片段，将其开发为分子标记，在交换单株中进行扫描，结果表明在该标记处交换单株的瓣型和基因型完全连锁。利用上述构建的分离群体进行bsa-rna
测序，通过对rna-seq数据进行无参转录组分析，根据差异表达筛选snp位点、设计多对引物，利用亲本(纯合平瓣基因池、纯合管瓣基因池)、f1(杂合平瓣基因池)、极端混合池(bc1分离群体中的平瓣基因混合池、管瓣基因混合池)，筛选出多对多态性引物。
31.2)利用多态性引物对分离群体进行扫描，筛选交换单株，初定位将管瓣基因定位于开发的舌状花管瓣性状高度连锁的多个相关标记之间。以近源物种向日葵、生菜基因组为参考，初定位获得的连锁标记均分别blastx比对到向日葵chr12、生菜chr3上，调取对应区域的基因序列，利用blast软件将转录组数据与之比对，筛选具有snp位点的共线性序列，设计引物对交换单株进行分型鉴定进一步将管瓣基因定位于相关标记之间。
32.3)由于缺乏基因组未能进一步缩小定位区间，考虑到物种进化过程中染色体可能存在倒位、异位等，因此调取向日葵chr12、生菜chr3定位区间两侧的所有基因序列，利用blast软件将转录组数据与之比对，结合功能注释筛选表达量有显著差异的基因。
33.4)根据筛选的差异表达基因序列设计引物，以亲本dna(纯合平瓣和纯合管瓣基因组)为模板进行扩增筛选多态性引物，以初定位筛选出的交换单株dna为模板进行扩增，统计基因型，最终获得1个表型和基因型完全连锁的标记，获得1个凸显平瓣和管瓣材料中差异的标记序列。
34.本发明的有益效果：
35.本发明现有的pcr技术和转录组序列信息挖掘发现在百日草管瓣亲本a1gh的cyc基因中发现一段序列，从而成功得到了百日草舌状花瓣型性状的共显性indel分子标记，运用该标记可以在杂交后代早期(2周以内)进行分子标记诊断，而传统育种等待开花需要两个月时间，相比之下，该标记应用于辅助育种具有时间早、成本低的优势。
附图说明
36.图1为试验材料田间照片
37.图中，a.纯合平瓣a1gh、b.纯合管瓣s5、c.a1gh
×
s5杂交一代；
38.图2为本发明中百日草cyc基因扩增发现的多态性条带
39.图中，纯合平瓣(s5)的基因组扩增条带为442bp，纯合管瓣(a1gh)的基因组扩增条带为2596bp；
40.图3为引物对分别在百日草瓣型分离群体的单株基因组dna中的扩增结果图；
41.图中，双条带(2596bp/442bp)为平瓣的百日草(杂合)；
42.单条带(2596bp/442bp)为平瓣的百日草(纯合)；
43.单条带(2596bp)为管瓣的百日草(纯合)。
具体实施方式
44.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
45.实施例1
46.鉴定百日草瓣型分离群体基因型的方法
47.1.分单株制备分离群体的基因组dna
48.选取46个植株材料(包括22株平瓣植株和24株管瓣植株)，采用改良的ctab法分别提取46个植株材料的基因组dna；
49.2.利用引物对indel f/r扩增分析上述所有单株的基因组dna；
50.正向引物indel f：5
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aaaacccttgattggttgttcac
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3，
51.反向引物indel r：5
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atggctttggaggcttttctt
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3；
52.pcr反应：总体积10ul，其中待测百日草基因组dna模板0.5ul，正反引物各0.2nmol/ul，pcrmix 5ul，最后加入去离子水至总体积10ul；pcr反应条件为：94℃预变性2min后，循环30次94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s；最后72℃延伸2min；pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
53.如图2～3所述：扩增产物为442bp的单一亮带时，待植株材料为平瓣纯合，扩增产物为2596bp的单一亮带时，待植株材料为管瓣纯合，扩增产物为442bp、2596bp的两条亮带时，待植株材料为平瓣杂合；由此可知：有1个待植株材料为平瓣纯合，有21个待植株材料为杂合；有24个待植株材料为待植株材料为管瓣纯合。
54.其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。