1.本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及肉制品和鹿茸中梅花鹿和马鹿源性检测领域。


背景技术：

2.目前，动物制品真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、发明专利以及商业试剂盒主要集中在单一通道单一源性检测和异管质控检测，同时多通道多源性检测和同管质控检测报道较少。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的引物、探针及试剂盒和方法，解决肉制品或鹿茸中梅花鹿和马鹿源性成分定性和定量检测问题。
4.本发明的技术方案为：肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的引物和探针，引物和探针序列如下：
5.两源性检测正向引物序列如seq id no.1所示；
6.两源性检测反向引物序列如seq id no.2所示；
7.梅花鹿探针序列如seq id no.3所示；
8.马鹿探针序列如seq id no.4所示；
9.质控探针序列如seq id no.5所示。
10.进一步地，梅花鹿探针、马鹿探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为fam、hex、rox或cy5中的任意一种，淬灭基团为tamra、 bhq1或bhq2中任意一种。
11.作为本发明的另一目的，提供了一种肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
12.seq id no.1所示的两源性检测正向引物，
13.seq id no.2所示的两源性检测反向引物，
14.seq id no.3所示的梅花鹿探针，
15.seq id no.4所示的马鹿探针，
16.seq id no.5所示的质控探针，
17.probe qpcr预混液，
18.梅花鹿阳性标准品，
19.马鹿阳性标准品。
20.当然，也可以单独检测梅花鹿源性，为了节省成本，只需要去除马鹿源性相关的试剂即可(seq id no.4所示的马鹿探针和马鹿阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品或鹿茸中梅花鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
21.seq id no.1所示的两源性检测正向引物，
22.seq id no.2所示的两源性检测反向引物，
23.seq id no.3所示的梅花鹿探针，
24.seq id no.5所示的质控探针，
25.probe qpcr预混液，
26.梅花鹿阳性标准品。
27.当然，也可以单独检测马鹿源性，为了节省成本，只需要去除梅花鹿源性相关的试剂即可(seq id no.3所示的梅花鹿探针和梅花鹿阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品或鹿茸中马鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
28.seq id no.1所示的两源性检测正向引物，
29.seq id no.3所示的两源性检测反向引物，
30.seq id no.4所示的马鹿探针，
31.seq id no.5所示的质控探针，
32.probe qpcr预混液，
33.马鹿阳性标准品。
34.肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：
35.(1)提取肉制品或鹿茸的dna；
36.(2)检测dna的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μl；
37.(3)利用seq id no.1～seq id no.5的引物和探针对稀释dna进行多重荧光定量 pcr扩增，利用马鹿和梅花鹿阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用dna提取的空白对照做提取方法的对照组；
38.(4)real-time pcr反应结束后，设置threshold为自动，读取梅花鹿、马鹿和质控相应探针的ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的ct；只有当质控ct≤35和阳性对照 ct≤35，阴性对照和空白对照ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的 ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的ct≤35，结果判定为具有相应多源性；
39.(5)利用梅花鹿和马鹿阳性标准品做dna定量的标准曲线；
40.(6)利用检测肉制品和鹿茸的相应源性的ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品和鹿茸中相应源性的定量检测结果。
41.进一步地，real-time pcr扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40个循环。
42.进一步地，real-time pcr反应体系为：probe qpcr预混液10μl、seq id no.1所示的两源性检测正向引物1μl，浓度为10μmol/l；seq id no.2所示的两源性检测反向引物 1μl，浓度为10μmol/l；seq id no.3所示的梅花鹿探针0.5μl，浓度为10μmol/l；、seqid no.4所示的马鹿探针0.5μl，浓度为10μmol/l和seq id no.5所示的质控探针0.5μl，浓度为10μmol/l；dna模板2μl，灭菌的去离子水4.5μl，总体积20μl。
43.本发明通过比对梅花鹿、马鹿、牛、水牛、牦牛、驴、马、绵羊、山羊、猪、兔、骆驼、狗、鸡、鸭及鹅等16种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述120条序列，筛选出梅花鹿和马鹿保守和特异的序列，利用
引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个pcr反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量pcr反应的进行。多重实时荧光定量pcr反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。
44.本发明研发了梅花鹿、马鹿及质控等3通道检测引物和探针，优化多通道多源性检测和同管质控检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一pcr反应体系中多种引物和探针之间的影响以及对模板以及pcr反应资源的竞争的问题，达到pcr反应体系可以同时进行多重实时荧光pcr的效果。
45.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
46.本发明的引物、探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，可以实现肉制品和鹿茸中梅花鹿和马鹿源性的定性和定量检测，并且可以进行梅花鹿、马鹿和质控的同时检测，节省了工序，降低了成本。
附图说明
47.图1利用fam和tamra修饰探针标记梅花鹿源性、hex和tamra修饰探针标记马鹿源性及rox和bhq2修饰探针标记质控对照对梅花鹿(鹿肉和鹿茸)、牛、水牛、牦牛、驴、马、绵羊、山羊、猪、兔、骆驼、狗、鸡、鸭及鹅等15种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量pcr的检测，梅花鹿肉和茸中出现扩增曲线，其它肉都没有出现扩增曲线，说明梅花鹿源性引物和探针具有特异性。
48.图2利用fam和tamra修饰探针标记梅花鹿源性、hex和tamra修饰探针标记马鹿源性及rox和bhq2修饰探针标记质控对照对马鹿(鹿肉和鹿茸)、牛、水牛、牦牛、驴、马、绵羊、山羊、猪、兔、骆驼、狗、鸡、鸭及鹅等15种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量pcr的检测，马鹿肉和茸中出现扩增曲线，其它肉都没有出现扩增曲线，说明马鹿源性引物和探针具有特异性。
49.图3利用fam和tamra修饰探针标记梅花鹿源性对梅花鹿dna(100ng、10ng、1 ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，梅花鹿源性探针可以检测到0.1pg的梅花鹿源性dna。以上结果说明梅花鹿探针在肉制品和鹿茸的源性检测方面具有较高的灵敏度。
50.图4利用hex和tamra修饰探针标记马鹿源性对马鹿dna(100ng、10ng、1ng、 0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，马鹿源性探针可以检测到0.1pg的马鹿源性dna。以上结果说明马鹿探针在肉制品和鹿茸的源性检测方面具有较高的灵敏度。
51.图5梅花鹿源性检测标准曲线：用于肉制品和鹿茸中梅花鹿源性的定量检测。
52.图6马鹿源性检测标准曲线：用于肉制品和鹿茸中马鹿源性的定量检测。
53.图7利用fam和tamra修饰探针标记梅花鹿源性、hex和tamra修饰探针标记马鹿源性及rox和bhq2修饰探针标记质控对照对混合样品(30％梅花鹿肉和70％马鹿)进行梅花
鹿、马鹿和质控的同时检测，梅花鹿源性(sika deer-fam)、马鹿源性(red deer
‑ꢀ
hex)及质控对照(control-rox)都出现扩增曲线。以上结果说明混合探针(梅花鹿、马鹿以及质控对照)具有梅花鹿源性、马鹿源性以及质控对照同时同管检测能力。
具体实施方式
54.1、检测方法：
55.(1)提取样品(肉和茸)的dna，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。
56.(2)检测dna的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μl。
57.(3)利用多重荧光定量pcr引物和探针对稀释dna进行扩增检测，利用梅花鹿和马鹿阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用dna提取的空白对照做提取方法的对照组，real-time pcr反应体系如表1所示，real-time pcr扩增参数如表4所示。
58.表1 real-time pcr反应体系(梅花鹿、马鹿和质控的同时检测)
[0059][0060][0061]
表2 real-time pcr反应体系(梅花鹿源性以及质控同时检测)
[0062]
成分体积(微升)probe qpcr预混液10两源性检测正向引物1两源性检测反向引物1梅花鹿探针0.5质控探针0.5dna2灭菌的去离子水5总体积20
[0063]
表3 real-time pcr反应体系(马鹿源性以及质控同时检测)
[0064]
成分体积(微升)
probe qpcr预混液10两源性检测正向引物1两源性检测反向引物1马鹿探针0.5质控探针0.5dna2灭菌的去离子水5总体积20
[0065] 表4 real-time pcr扩增参数
[0066][0067]
(4)real-time pcr反应结束后，设置threshold为自动，读取梅花鹿、马鹿和质控相应探针的ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的ct；只有当质控ct≤35和阳性对照 ct≤35，阴性对照和空白对照ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的 ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的ct≤35，结果判定为具有相应多源性。
[0068]
(5)利用梅花鹿和马鹿阳性标准品(稀释101到107倍)做dna定量的标准曲线。
[0069]
(6)利用检测肉制品和鹿茸的相应源性的ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品和鹿茸中相应源性的定量检测结果。
[0070]
2、引物和探针序列的设计
[0071]
由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在动物制品中相对稳定，所以选择线粒体基因设计梅花鹿、马鹿和质控检测引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照发明的序列进行合成和纯化。
[0072]
两源性检测正向引物：5'cctagcaatagcatgattcctc 3'(seq id no.1)，
[0073]
两源性检测反向引物：5'gagccaaattgggcggattt 3'(seq id no.2)，
[0074]
梅花鹿探针：5'cattaggggtatgttggagttgtttggtg 3'(seq id no.3)，
[0075]
马鹿探针：5'ctattaggggtatattggagtcgtttgggt 3'(seq id no.4)，
[0076]
质控探针：5'ccagttgcggctagtgcaaggc 3'(seq id no.5)；
[0077]
梅花鹿、马鹿和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为fam、hex、rox或cy5中的任意一种，所述淬灭基团为tamra、bhq1或 bhq2中任意一种。
[0078]
3、引物和探针的特异性检测
[0079]
单源性检测的real-time pcr反应体系如下表所示
[0080][0081][0082]
利用fam和tamra修饰探针标记梅花鹿源性、hex和tamra修饰探针标记马鹿源性及rox和bhq2修饰探针标记质控对照对梅花鹿(鹿肉和鹿茸)、马鹿(鹿肉和鹿茸)、牛、水牛、牦牛、驴、马、绵羊、山羊、猪、兔、骆驼、狗、鸡、鸭及鹅进行qpcr的检测。
[0083]
检测结果如下：
[0084][0085][0086]
ct值：平均值(三组数据)
±
标准差；n/a:不适用于检测
[0087]
结果说明：ct小于35(不为0)说明样品中有相应源性。检测结果符合样品动物来源。在梅花鹿肉和梅花鹿茸中检测出梅花鹿源性，在马鹿肉和马鹿茸中检测出马鹿源性，而在其他肉中没有检测到梅花鹿和马鹿源性。
[0088]
4、相应源性检测的引物和探针的检测限度实验
[0089]
将梅花鹿和马鹿(鹿肉和鹿茸)的基因组dna分别稀释101到107倍(共8个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，梅花鹿源性探针可以检测到样品中100fg的梅花鹿源性dna，马鹿源性探针可以检测到样品中100fg的马鹿源性 dna。以上结果说明自主研发的梅花鹿和马鹿引物和探针的检测限度达到fg水平，检测的灵敏度较高。
[0090]
检测结果如下：
[0091][0092]
ct值：平均值(三组数据)
±
标准差；n/a:不适用于检测
[0093]
5、利用fam和tamra修饰探针标记梅花鹿源性、hex和tamra修饰探针标记马鹿源性及rox和bhq2修饰探针标记质控对照对梅花鹿肉和马鹿肉梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、70％、90％、99％和99.9％)进行梅花鹿、马鹿和质控的同时检测。
[0094]
检测结果如下：
[0095][0096][0097]
ct值：平均值(三组数据)
±
标准差
[0098]
结果说明：ct小于35(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。结果显示梅花鹿探针都可以检测到10％水平混合样品，马鹿探针都可以检测到10％水平混合样品。以上结果说明混合探针(梅花鹿、马鹿以及质控对照)具有梅花鹿源性、马鹿源性以及质控对照同管检测能力。
[0099]
6、利用fam和tamra修饰探针标记源性和hex和tamra修饰探针标记马鹿源性分别对梅花鹿肉和马鹿肉梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、70％、90％、99％和 99.9％)进行梅花鹿和马鹿源性的分别检测。
[0100]
检测结果如下：
[0101][0102]
ct值：平均值(三组数据)
±
标准差；n/a:不适用于检测
[0103]
结果说明：ct小于35(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。结果显示梅花鹿、马鹿探针都可以检测到0.1％水平混合样品。以上结果说明梅花鹿和马鹿探针具有千分之一掺假的检测能力。
[0104]
7、试剂盒制作
[0105]
(1)梅花鹿源性、马鹿源性同步检测试剂盒试剂如下表所示：
[0106]
试剂说明probe qpcr预混液反应体系(酶、dntp、mg
2+
)两源性检测正向引物浓度为10μmol/l两源性检测反向引物浓度为10μmol/l梅花鹿探针浓度为10μmol/l马鹿探针浓度为10μmol/l质控探针浓度为10μmol/l梅花鹿阳性标准品浓度为100ng/μl，用于梅花鹿阳性对照及标准曲线马鹿阳性标准品浓度为100ng/μl，用于马鹿阳性对照及标准曲线灭菌的去离子水补充反应体系
[0107]
(2)梅花鹿源性检测试剂盒试剂如下表所示：
[0108]
试剂说明probe qpcr预混液反应体系(酶、dntp、mg
2+
)两源性检测正向引物浓度为10μmol/l两源性检测反向引物浓度为10μmol/l梅花鹿探针浓度为10μmol/l
质控探针浓度为10μmol/l梅花鹿阳性标准品浓度为100ng/μl，用于梅花鹿阳性对照及标准曲线灭菌的去离子水补充反应体系
[0109]
(3)马鹿源性检测试剂盒试剂如下表所示：
[0110][0111]