eudesmanolide倍半萜类化合物及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于海洋生物医药技术领域，具体涉及一种从北极土壤弯孢聚壳属真菌d-1(eutypella sp.d-1)中经固体培养基高产发酵、提取、分离纯化得到的eudesmanolide类化合物及其制备方法与在制备抗菌药物中的应用。


背景技术：

2.南北两极地区极端的生存环境，导致极地真菌在进化的过程中形成了独特的防御能力，从而产生许多结构新颖、活性显著的次级代谢产物，这些代谢产物是创新药物的重要来源和新的突破口，一直是天然药物学家的研究对象。药源材料eutypella sp.d-1分离自北极高纬度(78
°
55’n)仙女木根基土壤，隶属于子囊菌门ascomycetes、炭角菌目xylariales、胶孢壳科diatrypaceae、弯孢聚壳属eutypella。目前，文献报道该种属的次级代谢产物主要包括桉烷型倍半萜、海松烷二萜、甾体、苯并吡喃衍生物、γ-内酯类以及细胞松弛素类化合物等。这些化合物存在着多种生物活性，如抗肿瘤、神经毒性、抗疟、抗菌等，从该种属中分离得到的海松烷二萜化合物libertellenone c有非常良好的抗菌活性(参见文献：谭俊杰,张捷,李医明.弯孢聚壳属真菌次级代谢产物及其生物活性.菌物学报,2017,36(9):1181-1191.)。
3.目前，报道的源于该种属的eudesmanolide类化合物的产量极低，严重限制其后续应用。发明人卢小玲前期(natural product research,2017,3,1676-1681)报道了化合物2eut-guaiane sesquiterpene的提取制备方法，但产量极低，仅有0.1％，如何获得高产量和高纯度并适合药物开发的化合物2eut-guaiane sesquiterpene的发酵、提取和分离方法，仍是目前需要解决的技术问题。本发明采用合成固体培养基进行发酵，化合物2eut-guaiane sesquiterpene的产量是前期报道的液体培养基产量的500倍。同时，至今未见从该属真菌中分离得到具有抗菌活性的eudesmanolide类化合物1的报道；也未见化合物2eut-guaiane sesquiterpene对粪肠球菌(enterococcusfaecalis)和绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)具有抗菌活性的报道。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的是提供一种eudesmanolide倍半萜类化合物。
5.本发明的第二目的是提供一种所述eudesmanolide倍半萜类化合物的制备方法。
6.本发明的第三目的是提供一种所述eudesmanolide倍半萜类化合物在制备抗菌药物中的应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明的第一方面提供了一种eudesmanolide倍半萜类化合物，结构为以下结构的一种：
[0009][0010]
所述eudesmanolide倍半萜类化合物是从北极土壤弯孢聚壳属真菌d-1(eutypella sp.d-1)中经提取、分离纯化得到。
[0011]
本发明的第二方面，提供了一种所述eudesmanolide倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
第一步，制备总提物
[0013]
从保种平板上挑取少量保藏编号为cctcc no：m 2013144的弯孢聚壳菌d-1(eutypella sp.d-1)的菌丝体，接种到250ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装100ml的pdb培养基，28℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养3.5天后获得种子液；然后将种子液按照5％v/v的接种量接种到装有200ml固体发酵培养基的20mm
×
20cm培养皿中进行扩大培养，置于20℃静置培养45天获得发酵液。
[0014]
所述pdb培养基配方为：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
[0015]
所述固体发酵培养基配方为：蔗糖51.4g/l，硝酸钠3.3g/l，尿素2.5g/l，酵母提取物0.7g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，七水硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，六水氯化钴3.125mg/l，琼脂20g/l。
[0016]
将上述培养得到的发酵液过滤，分别获得菌体和菌液；菌液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液蒸干溶剂得到第一部分浸膏；菌体用二氯甲烷:甲醇＝1:1超声提取3次，30min/次，浓缩提取液至无有机溶剂，加水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液蒸干溶剂得到第二部分浸膏；将上述第一部分浸膏和第二部分浸膏合并获得总提物；
[0017]
第二步，分离纯化
[0018]
将上述总提物经减压液相柱色谱vlc，以石油醚:乙酸乙酯＝100:1，80:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到20个组分fr.a-t；
[0019]
组分fr.k经反相高效液相纯化，条件为65％甲醇/水，流速2ml/min，检测波长为280nm，保留时间为37分钟，得到化合物1；保留时间为39分钟，得到化合物2。
[0020]
所述化合物1、化合物2的结构如下所示：
[0021][0022]
本发明的第三方面，提供了一种eudesmanolide倍半萜类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗菌药物中的应用。
[0023]
所述eudesmanolide倍半萜类化合物的结构为以下结构的一种：
[0024][0025]
所述抗菌药物指的是抗大肠杆菌(escherichia coli)药物、抗枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)药物、抗金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)药物、抗粪肠球菌(enterococcus faecalis)药物、抗绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)药物。
[0026]
体外抗菌实验结果显示，本发明的化合物对大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)的生长都具有强烈的抑制活性，其抑菌活性mic值大小与阳性对照药氨苄西林相当。
[0027]
本发明的化合物1和化合物2eut-guaiane sesquiterpene的抑菌活性和抗菌谱优于文献报道(the journal ofantibiotics(2017),1
–
4)的同类化合物13-hydroxy-3,8,7(11)-eudesmatrien-12,8-olide的抑制活性；本发明化合物1对枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的抗菌活性mic值为2μg/ml(8.1μm)，远优于化合物13-hydroxy-3,8,7(11)-eudesmatrien-12,8-olide的抗菌活性(18.1μm)。
[0028]
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
[0029]
本发明的eudesmanolide倍半萜类化合物为研究和开发新的抗菌药物提供了新的先导化合物，为开发利用我国极地药用资源提供了科学依据。
[0030]
本发明的eudesmanolide倍半萜类化合物经体外活性试验证明，具有显著的抗菌活性，因此，可以将它们用于抗菌药物的开发。
[0031]
抗菌活性筛选结果提示，本发明化合物具有较好的抗菌谱，对多种细菌具有显著的抗菌活性。
[0032]
本发明采用固体培养基进行发酵，eudesmanolide类化合物eut-guaiane sesquiterpene的产量是液体培养基产量的500倍。现有技术中采用的pdb液体培养基发酵总浸膏为6.34g，制备获得纯度》98％的化合物eut-guaiane sesquiterpene为7.0mg，产率为0.11％，本发明采用合成固体培养基发酵总浸膏为6.84g，制备获得纯度》98％的化合物2eut-guaiane sesquiterpene为3.78g，产率为55.26％。本发明产量是其500倍；现有技术未见关于化合物1的文献报道。
[0033]
生物材料样品的保藏信息：
[0034]
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
[0035]
地址：武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)
[0036]
保藏日期：2013年4月12日
[0037]
保藏编号：cctcc no：m2013144
[0038]
分类命名：eutypella sp.d-1
具体实施方式
[0039]
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领
域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0040]
实施例1
[0041]
本发明化合物的发酵与制备
[0042]
本发明所用的菌种是分离自北极地区kongsfjorden的伦敦岛(海拔100米)土壤样品的弯孢聚壳菌d-1(eutypella sp.d-1)，已于2013年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏编号为cctcc no：m 2013144。
[0043]
第一步，制备总提物
[0044]
从保种平板上挑取少量保藏编号为cctcc no：m 2013144的弯孢聚壳菌d-1(eutypella sp.d-1)的菌丝体，接种到250ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装100ml的pdb培养基，28℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养3.5天后获得种子液；然后将种子液按照5％(v/v)的接种量接种到装有200ml固体发酵培养基的20mm
×
20cm培养皿中进行扩大培养，置于20℃静置培养45天获得发酵液。
[0045]
所述pdb培养基配方为：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
[0046]
所述固体发酵培养基配方为：蔗糖51.4g/l，硝酸钠3.3g/l，尿素2.5g/l，酵母提取物0.7g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，七水硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，六水氯化钴3.125mg/l，琼脂20g/l。
[0047]
将上述培养得到的发酵液过滤，分别获得菌体和菌液；菌液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液蒸干溶剂得到第一部分浸膏；菌体用二氯甲烷:甲醇＝1:1超声提取3次，30min/次，浓缩提取液至无有机溶剂，加水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液蒸干溶剂得到第二部分浸膏；将上述第一部分浸膏和第二部分浸膏合并获得总提物6.84g；
[0048]
第二步，分离纯化
[0049]
将上述总提物经减压液相柱色谱vlc(直径10cm，高20cm)，以石油醚:乙酸乙酯＝100:1，80:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到20个组分fr.a-t；
[0050]
组分fr.k经反相高效液相(色谱柱：ymc-pack pro c18 rs，5μm)纯化，条件为65％甲醇/水，流速2ml/min，检测波长为280nm，保留时间为37分钟，得到纯度》98％的化合物1，质量为1.20g，产率为17.5％；保留时间为39分钟，得到纯度》98％的化合物2，质量为3.78g，产率为55.26％。
[0051]
化合物1和化合物2的结构如下所示：
[0052][0053]
第三步，结构鉴定
[0054]
化合物1和化合物2经nmr、hresims、uv等多种现代光谱技术，确定了化学结构。
[0055]
化合物1：淡黄色油状物；uv(meoh)λ
max 278(3.98),225(3.66)；hresims m/z[m+na]
+
269.1153(calcd.c
15h18
o3na),1h和3c nmr核磁共振谱数据见表1所示。
[0056]
化合物2：淡黄色油状物；uv(meoh)λ
max 280(4.79),211(3.96)；hresims m/z[m+h]
+
247.1342(calcd.c
15h19
o3),1h和3c nmr核磁共振谱数据见表1所示。
[0057]
表1化合物1和化合物2的核磁共振谱数据
[0058][0059][0060]
a measured at 500mhz in cdcl3；
b measured at 125mhz in cdcl3.
[0061]
实施例2
[0062]
本发明化合物的体外抗菌活性实验：
[0063]
实验方法：改良肉汤稀释法(waitz ja.methods for dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically；approved standard—eighth edition.clinical&laboratory standards institute,2002.)
[0064]
分别取50μl待测指示菌株的菌液加入含营养肉汤培养基的试管中，37℃，180r/min摇床培养10h进行活化，测定od值范围为0.6-0.8方可后续使用。将上述活化的菌液用灭菌的营养肉汤按1:1000稀释后备用。将样品和阳性对照氯霉素分别用dmso溶解成1mg/ml，之后用营养肉汤稀释成浓度为128μg/ml。取灭菌的96孔板，第一孔直接加200μl的样品原液，其余每孔加入营养肉汤100μl，从第一孔中吸出100μl加入第二孔，混匀再吸取100μl至第3孔，如此连续倍半稀释至第8孔，并从第9孔中吸取100μl弃去，第9孔为空白对照，随后将
96孔板放于37℃培养箱中培养16h，以恰好能够完全抑制小孔内细菌生长的药物浓度为最小抑菌浓度(mic)，结果如表3所示。
[0065]
表3：化合物抗指示菌最小抑菌浓度(mic，μg/ml)
[0066][0067]
实验结果：结果显示，本发明的化合物1和化合物2对大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、粪肠球菌(e.faecalis)、绿脓杆菌(p.aeruginosa)都具有很好的抑制活性，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性与阳性对照氯霉素相当，表明化合物具有抗菌活性，因此本发明的化合物1和化合物2可以作为抗菌药物的先导化合物。
[0068]
对比例1
[0069]
文献(natural product research,2017,3,1676-1681)报道了化合物2eut-guaiane sesquiterpene的提取制备方法，但产量极低，仅有0.1％。具体的提取制备方法包括以下步骤：
[0070]
第一步，制备总提物
[0071]
将保藏编号为cctcc no：m 2013144的弯孢聚壳菌d-1(eutypella sp.d-1)在pda培养基上20℃培养7天，然后3片(0.5
×
0.5cm2)含菌丝体pda琼脂片接种到60
×
250ml锥形培养瓶中，每个烧瓶含有70ml的pdb。在20℃，180r/min条件下，振荡培养5天后得到种子液，然后将70ml种子培养物转移到总共60个锥形培养瓶(2l)中，每瓶含有700ml的pdb，随后在20℃，180r/min条件下，振荡培养9天。
[0072]
所述pdb培养基配方为：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
[0073]
所述pda培养基配方为：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，琼脂30g，蒸馏水1000ml。
[0074]
将上述培养得到的发酵液过滤，菌液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于40℃以下条件减压浓缩，得到总提物6.34g；
[0075]
第二步，分离纯化
[0076]
将上述总提物经sephadex lh-20凝胶柱色谱(10
×
100cm)，以甲醇为溶剂进行洗脱(5
×
1l)，得到6个组分fr.a-f；
[0077]
组分fr.e经反相中压液相，以甲醇/水(5
–
100％)为溶剂进行梯度洗脱，得到5个组分fr.c1-c5；
[0078]
组分fr.c4经正相硅胶柱色谱，以石油醚/乙酸乙酯为溶剂进行洗脱，得到纯度》98％的化合物2质量为7.0mg，产率为0.11％。
[0079]
文献报道的pdb液体培养基发酵总浸膏为6.34g，制备获得纯度》98％的化合物2eut-guaiane sesquiterpene为7.0mg，产率为0.11％。本发明采用的合成固体培养基发酵总浸膏为6.84g，制备获得纯度》98％的化合物2eut-guaiane sesquiterpene为3.78g，产率
为55.26％。本发明产率是其500倍；此外，文献没有关于化合物1的报道。
[0080]
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。