1.本发明涉及食品工程领域，具体为一种紫薯蛋白多酚复合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.紫薯又叫黑薯，其富含蛋白质、淀粉、果胶、纤维素、氨基酸、维生素及多种矿物质，同时还富含硒元素和花青素。
3.目前紫薯加工产品多为糖类产品，其主要利用淀粉酶、麦芽、糖化酶的酵解作用制成糖类成分复杂的糖浆、饮料等。但对于紫薯蛋白的提取制备、加工、应用等目前尚无成熟技术。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种紫薯蛋白多酚复合物及其制备方法和应用，其通过多级盐析的方式沉淀蛋白质，以大幅提高紫薯蛋白的提取效率和质量，同时制备获得的产物还可作为天然降血糖物质应用于降低机体血糖，防治糖尿病。
5.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：
6.提供了一种紫薯蛋白多酚复合物的制备方法，其包括如下步骤：
7.s1、挑选无损伤、无腐烂的新鲜紫薯洗净，去皮后切块，加入蒸馏水以及质量分数为1-2％的柠檬酸溶液进行打浆，以获得原料浆液；随后进行酶解，以获得紫薯酶解浆液；
8.s2、对所述紫薯浆液进行高压脉冲电场处理，然后再进行高压均质处理；
9.s3、经步骤s2处理后的提取液在3000-5000r/min条件下离心20-30min，得第一上清液以及第一沉淀；第一上清液中添加硫酸铵至饱和度35％，在4℃下搅拌0.5-1h后，在3000-5000r/min条件下离心20-30min，得到第二沉淀以及第二上清液；取第二上清液，添加硫酸铵至饱和度60％，在4℃下搅拌1-1.5h后，在4000-5000r/min条件下离心15-25min，得到第三沉淀以及第三上清液；取第三上清液，添加硫酸铵至饱和度90％，在4℃下搅拌1-1.5h后，经4000-6000r/min离心10-20min，得到第四沉淀以及第四上清液；
10.s4、合并第二沉淀、第三沉淀以及第四沉淀，干燥后得到第一紫薯多酚蛋白粗提物；
11.s5、合并第一上清液、第二上清液、第三上清液以及第四上清液，使用大孔树脂对合并后的上清液进行吸附-解析，上柱流速为3-5bv/h，透过液冷冻干燥后得到第二紫薯多酚蛋白粗提物；
12.以及s6、合并第一紫薯多酚蛋白提取物以及第二紫薯多酚蛋白粗提物，以得到所述紫薯蛋白多酚复合物。
13.优选的，步骤s1中，柠檬酸溶液质量分数为1-2％，蒸馏水的重量和是紫薯重量的2-3倍；且质量分数为1-2％的柠檬酸溶液与蒸馏水的体积比为1：3。
14.优选的，步骤s1中，所述酶解条件为：加入原料浆液质量的1-2％的α-淀粉酶，调节
ph至4.5-5.5，酶解温度45-55℃，酶解时间1-1.5h。
15.优选的，步骤s2中，所述高压脉冲电场强度为20-40kv
·
cm-1
，且作用在紫薯浆液上的时间为4.5μs；所述高压均质压力为50-100mpa，均质时间为30min；
16.优选的，步骤s4包括：合并第二沉淀、第三沉淀以及第四沉淀，然后进行透析/纳滤膜脱盐，直至透过液的电阻率为8-10μs/cm；然后干燥后得到第一紫薯多酚蛋白提取物；纳滤膜脱盐时采用的纳滤膜截留分子量为150-500da。
17.还提供一种利用上述制备方法制备获得的紫薯蛋白多酚复合物。
18.还提供一种上述紫薯蛋白多酚复合物在制备降血糖食品/药品/保健品中的应用。
19.本发明结合酶解、高压脉冲电场以及高压均质对紫薯原料进行处理，进一步通过在不同阶段添加不同量的硫酸铵，以多级盐析的方式充分沉淀紫薯蛋白质，以大幅提高紫薯蛋白的提取效率和质量，同时制备获得的产物还可作为天然降血糖物质应用于降低机体血糖，防治糖尿病。
附图说明
20.图1中为紫薯蛋白多酚复合物经sds-page电泳后的结果图。
21.图2为不同处理对高脂饮食/链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠空腹血糖的影响(n＝7-10)。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1：
24.本实施例提供了一种紫薯蛋白多酚复合物的制备方法，其包括如下步骤：
25.s1、挑选无损伤、无腐烂的新鲜紫薯洗净，去皮后切块，加入蒸馏水以及质量分数为1％的柠檬酸溶液打浆，以获得原料浆液，再加入原料浆液质量的1％的α-淀粉酶，调节ph至4.5，酶解温度45℃，酶解时间1h，以获得紫薯浆液；具体的，质量分数为1％的柠檬酸溶液与蒸馏水的重量和是紫薯重量的2倍；且质量分数为1％的柠檬酸溶液与蒸馏水的体积比为1：3；
26.由此可先通过酸溶液破坏细胞壁、细胞膜等结构，增加细胞壁、细胞膜透性，使细胞内容物(如蛋白质、多肽等)充分释放，进一步采用α-淀粉酶以提高蛋白提取质量和产量；
27.s2、对所述紫薯浆液进行高压脉冲电场处理，然后再进行高压均质处理；其中，所述高压脉冲电场强度为20kv
·
cm-1
，且作用在紫薯浆液上的时间为4.5μs；所述高压均质压力为50mpa，均质时间为30min；
28.s3、经步骤s2处理后的提取液在3000r/min条件下离心20min，得第一上清液以及第一沉淀；第一上清液中添加硫酸铵至饱和度35％，在4℃下搅拌0.5h后，在3000r/min条件下离心20min，得到第二沉淀以及第二上清液；取第二上清液，添加硫酸铵至饱和度60％，在4℃下搅拌1-1.5h后，在4000r/min条件下离心15min，得到第三沉淀以及第三上清液；取第
三上清液，添加硫酸铵至饱和度90％，在4℃下搅拌1h后，经4000r/min离心10min，得到第四沉淀以及第四上清液；本步骤中，通过在不同阶段添加不同量的硫酸铵，使其达到不同的饱和度，由此可通过该多级盐析的方式充分沉淀紫薯蛋白质；
29.s4、合并第二沉淀、第三沉淀以及第四沉淀，然后进行透析/纳滤膜脱盐，直至透过液的电阻率为8-10μs/cm，干燥后得到第一紫薯多酚蛋白提取物；纳滤膜脱盐时采用的纳滤膜截留分子量为150-500da，由此可通过透析/纳滤膜充分脱盐，以保证提取蛋白的纯度和质量；
30.s5、合并第一上清液、第二上清液、第三上清液以及第四上清液，使用大孔树脂对合并后的上清液进行吸附-解析，上柱流速为3bv/h，透过液冷冻干燥后得到第二紫薯多酚蛋白粗提物；
31.s6、合并第一紫薯多酚蛋白提取物以及第二紫薯多酚蛋白粗提物，以得到所述紫薯蛋白多酚复合物。
32.实施例2：
33.本实施例与实施例1的不同之处仅在于，本实施例的步骤s1中，加入质量分数为2％的柠檬酸溶液以及蒸馏水打浆，以获得原料浆液，再加入原料浆液质量的2％的α-淀粉酶，调节ph至5.5，酶解温度55℃，酶解时间1.5h，以获得紫薯浆液；且质量分数为2％的柠檬酸溶液与蒸馏水的重量是紫薯重量的3倍；且质量分数为2％的柠檬酸溶液与蒸馏水的体积比为1：3；
34.步骤s2中，所述高压脉冲电场强度为40kv
·
cm-1
，所述高压均质压力为100mpa；
35.步骤s3中，经步骤s2处理后的提取液在5000r/min条件下离心30min，得第一上清液以及第一沉淀；第一上清液中添加硫酸铵至饱和度35％，在4℃下搅拌1h后，在5000r/min条件下离心30min，得到第二沉淀以及第二上清液；取第二上清液，添加硫酸铵至饱和度60％，在4℃下搅拌1.5h后，在5000r/min条件下离心25min，得到第三沉淀以及第三上清液；取第三上清液，添加硫酸铵至饱和度90％，在4℃下搅拌1.5h后，经6000r/min离心20min，得到第四沉淀以及第四上清液；
36.步骤s5中，上柱流速为5bv/h。
37.其他与实施例1相同，在此不再赘述。
38.实施例3：
39.本实施例与实施例1的不同之处仅在于，本实施例的步骤s1中，加入质量分数为1.5％的柠檬酸溶液以及蒸馏水打浆，以获得原料浆液，再加入原料浆液质量的1.5％的α-淀粉酶，调节ph至5.0，酶解温度50℃，酶解时间75min，以获得紫薯浆液；且质量分数为1.5％的柠檬酸溶液与蒸馏水的重量和是紫薯重量的2.5倍；且质量分数为1.5％的柠檬酸溶液与蒸馏水的体积比为1：3；
40.步骤s2中，所述高压脉冲电场强度为25kv
·
cm-1
，所述高压均质压力为80mpa；
41.步骤s3中，经步骤s2处理后的提取液在4000r/min条件下离心25min，得第一上清液以及第一沉淀；第一上清液中添加硫酸铵至饱和度35％，在4℃下搅拌75min后，在4000r/min条件下离心25min，得到第二沉淀以及第二上清液；取第二上清液，添加硫酸铵至饱和度60％，在4℃下搅拌80min后，在4500r/min条件下离心20min，得到第三沉淀以及第三上清液；取第三上清液，添加硫酸铵至饱和度90％，在4℃下搅拌70min后，经5000r/min离心
15min，得到第四沉淀以及第四上清液；
42.步骤s5中，上柱流速为4bv/h。
43.其他与实施例1相同，在此不再赘述。
44.实施例4：
45.本实施例提供了一种利用实施例1-3任一项所述制备方法制备获得的紫薯蛋白多酚复合物。
46.实施例5：
47.本实施例提供了一种实施例4所述制备方法制备获得的紫薯蛋白多酚复合物在制备降血糖食品/药品/保健品中的应用。
48.表1示出了不同提取方法对紫薯多酚紫薯蛋白得率的影响。
49.表1不同提取方法对紫薯多酚紫薯蛋白得率的影响
[0050][0051]
注：表1中常规提取指的是打浆后直接离心处理。
[0052]
从表1中可以看出，本发明中通过先柠檬酸处理，然后酶解完毕后再对所述紫薯浆液进行高压脉冲电场处理+高压均质处理，由此可充分促使细胞内容蛋白的析出，因此本发明的紫薯多酚蛋白复合物得率为2.13％，显著高于单一处理方式，如单一超声处理、单一高压脉冲电场处理所获得的蛋白得率。
[0053]
表2示出了不同硫酸铵浓度对沉淀所得紫薯多酚蛋白复合物的蛋白纯度、占比的影响。
[0054]
表2不同硫酸铵浓度对紫薯多酚蛋白复合物的蛋白纯度、占比的影响
[0055] 蛋白纯度占比第二沉淀(硫酸铵饱和度35％)49.53
±
0.04％15.77％第三沉淀(硫酸铵饱和度60％)72.23
±
0.07％60.01％第四沉淀(硫酸铵饱和度90％)46.84
±
0.03％24.22％
[0056]
从表2中可以看出，通过在不同阶段添加不同量的硫酸铵，以多级盐析的方式充分沉淀紫薯蛋白质，使得不同阶段沉淀得到的紫薯蛋白均具有较高的纯度和占比，由此使得最终获得的紫薯蛋白提取效率和质量均得以大幅提高。
[0057]
进一步的，本发明合并第一紫薯多酚蛋白提取物以及第二紫薯多酚蛋白提取物后得到的混合物的蛋白含量为62.50
±
0.09％，
[0058]
将本发明最终得到的紫薯多酚蛋白复合物进行sds-page分析，结果如图1所示。图
1中，“1”泳道为紫薯多酚蛋白复合物中的蛋白，其显示有58、22、18和12kda四个染色带，条带清晰且不含杂质。由此说明，本发明通过多级沉淀结合膜分离的方式可有效提取紫薯蛋白，提高紫薯蛋白多酚复合物的质量。
[0059]
进一步的，采用triple-tof-ms对最终获得的紫薯蛋白多酚复合物进行测定。利用peaks studio软件在uniport数据库中搜库分析，从紫薯蛋白中共鉴定17种蛋白质，其结果如表3所示。
[0060]
表3紫薯蛋白多酚复合物蛋白鉴定结果
[0061][0062]
由此可发现，本发明最终获得的紫薯蛋白多酚复合物主要包括具有生物活性的酶类和sporamin蛋白，包括sporamin a、sporamin b、β-淀粉酶、preprosporamin、多酚氧化酶、蛋白酶抑制剂、超氧化物歧化酶、紫色酸性磷酸酶、putative phd zinc finger蛋白、nbs-lrr蛋白和果胶乙酰酯酶。由此说明本发明的制备方法可最大限度的保留紫薯蛋白多酚复合物中的各种活性成分，减少制备过程中的损失，有利于其充分发挥其作用功效。
[0063]
以下为本发明最终获得的紫薯蛋白多酚复合物的降血糖功效测定过程。
[0064]
首先，链脲佐菌素(stz)可有效的破坏一部分β细胞，在高脂饲料喂养的同时腹腔注射stz可成功建立ⅱ型糖尿病模型。icr小鼠自由饮食1周适应环境后，随机分为8组(n＝12)，分组和给药情况如表4所示。经过4周的对应饮食和腹腔注射样品后，连续三次腹腔注射低剂量链脲佐菌素(stz)50mg/kg bw。在注射stz 2周后，尾部静脉取血，测定血糖值，取血糖值10～20μmol/ml的小鼠为造模成功小鼠。使用三诺安稳免调码血糖仪定空腹血糖浓度，每周测定一次。结果如图2所示。
[0065]
表4分组及给药情况
[0066][0067]
注：图2中*表示与正常组小鼠(n+c)有显著差异(p《0.05),#表示与模型组小鼠(d+hf)有显著差异(p《0.05)。
[0068]
从图2中可以看出，模型组小鼠(d+hf)空腹血糖浓度显著高于正常组小鼠(n+c)(p《0.05)，表现出典型的高血糖症状。紫薯花色苷组(d+fac-psp)、紫薯蛋白多酚复合物组(d+p-bac-psp)和阳性对照组小鼠(d+m)的空腹血糖浓度显著低于模型组(d+hf)(p《0.05)。实验数据表明本发明中的紫薯蛋白多酚复合物有显著的降血糖功效。
[0069]
综上所示，本发明结合酶解、高压脉冲电场以及高压均质对紫薯原料进行处理，进一步通过在不同阶段添加不同量的硫酸铵，以多级盐析的方式充分沉淀紫薯蛋白质，以大幅提高紫薯蛋白的提取效率和质量，同时制备获得的产物还可作为天然降血糖物质应用于降低机体血糖，防治糖尿病。
[0070]
需要说明的是，上述实施例1至5中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本发明的保护范围。术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0071]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。