专利名称：毒死蜱人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种毒死蜱人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途。
背景技术：
本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术领域，涉及有机合成，免疫化学及生物化学等，依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，定量地检测样本中超微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点，该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备，因此，目标分析物分子免疫学特性以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容，这一技术目前已成为农药残留痕量分析研究的一个崭新领域，被列为当前优先研究、开发和利用的农药残留分析技术，世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术，美国化学将免疫分析与气相色谱，液相色谱共同列为农药残留分析的支柱技术。
分子量小于1000道尔顿的小分子有毒化学品如农药及其代谢产物，传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)，液相色谱(HPLC)或质谱等物化分析手段，但由于农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧，对农药残留的限制也因此越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准，但传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、要求有熟练的技术人员及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管免疫分析应用于农药残留分析的时间很短，但已很快用于环境样品和食品中农药残留的分析。
1958年Berson S.A和Yallow创立了放射免疫分析法(RIA)，并首先在生物医学和临床药物定量测定得到广泛应用。由于农药残留分析对象的复杂性，直到八十年代免疫分析才被逐渐应用于这一领域，免疫学基本原理认为抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德化引力作用等多种因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可在体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。并且，快速、简便，适于检测生物大分子，也可以检测复杂样本中小分子如农药等痕量组分，，然而，与大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特点1)分子量小于1000道尔顿的小分子化合物一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体，必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构成有效人工物，才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。
2)虽然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可体外定量进行，遵循质量作用定律。如引入标记物放大显示这一反应，则其既具有免疫反应的特异性和灵敏性，又具有标记物易被识别和检测的双重特征，可分析环境、食品、人体液等复杂样本中超微量小分子化合物，具有较好的选择性，灵敏度。操作简单快速、成本低廉。
3)基于抗原抗体免疫反应检测小分子化合物的分析技术目前多采用酶免疫分析(EIA)。EIA利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度，近年来发展很快。这些技术使农药残留分析在方法上获得更大的生命力，对快速分析缺乏检测活性或样本基质过于复杂，因而用普通理化方法难以分析的农药残留，具有相当的应用价值。
第一个农药免疫分析的报道是1967年Centen等人制备的农药马拉硫磷的抗血清，通过抗原抗体沉淀反应，证明了抗血清与马拉硫磷的可反应性。从1967年到70年代末的10余年间，由于技术上的局限，尽管已开发出了几个农药的免疫分析方法，但仍未受到普遍重视，发展相当缓慢。主要原因是(1)八十年代前气相色谱法已经广泛应用，可满足大多数农药残留的测定，(2)残留的免疫分析涉及多个学科，研究工作较复杂，而免疫化学对于分析化学家是一个陌生的领域，另外，农药残留分析不同于医学临床化学分析，测定基质复杂。进入80年代以来，由于人们对分析方法的选择性和灵敏度的要求越来越高，同时对分析对象的种类和环境样品的数量要求也在不断增加，具有高度特异性、灵敏性、快速性的免疫检测技术在农药分析领域得到了较快的发展。进入90年代以来，农药的免疫检测技术发展迅速，到目前为止，已有60多种农药开发了免疫检测技术，其中除草剂和杀虫剂较多，杀菌剂较少。国内这方面的研究也渐渐起步，已有关于对硫磷、三唑酮、禾大壮、甲胺磷、莠去津均三氮苯类等农药的人工抗原和高亲合力的特异性抗体，用RIA法或ELISA法进行样品中痕量农药的分析。但总体来说，国内这方面的研究尚处于跟踪国外的发展。
毒死蜱[chlorpyrifos，O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯]，商品名为毒死蜱，乐斯本等，1965年由Dow Chemical Company推广使用的一种高效杀虫剂，在世界范围内应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。它对哺乳动物毒性中等，但对非靶标水生生物毒性较高。由于毒死蜱广泛地应用于农业生产上，在粮食等作物上引起的残留问题已有所报道。而且，环境样品中发现毒死蜱残留的情况也日趋严重，对人们的健康构成了潜在的威胁。因此，随着人们对毒死蜱残留的毒性与环境风险的日益关注，急需更科学、快捷和高效的检测手段。
检测毒死蜱残留量常规方法有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。然而这些方法的灵敏度受样品的净化，浓缩等步骤的影响很大；再者这些方法需要大多数实验室所不具备的复杂的仪器，且过程繁琐，不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为毒死蜱残留研究提供了一个新的分析检测途径，本发明的目的即是通过设计合成毒死蜱半抗原和人工抗原，免疫动物产生特异性抗体，以抗原抗体特异性免疫学反应为基础，引入标记物来放大显示这一反应，则可用于样本测定。其选择性于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此，可快速准确地分析检测毒死蜱在样本中的残留量。这种方法灵敏度高、特异性强，样品前处理简单，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。本研究拟通过制备抗毒死蜱多克隆抗体，建立毒死蜱的ELISA分析方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种毒死蜱人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途。
毒死蜱人工半抗原，其特征在于它的分子结构式为 其中PO为O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯 AR为O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯 人工半抗原O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯的制备方法的步骤如下1)按投料比为3∶1～6∶1将PSCl3和无水乙醇，装入置于-10℃±5℃的冰盐水浴中圆底三口烧瓶中，在磁力搅拌下，反应温度控制在-5℃±2℃，反应1～4h，副产物HCl用负压排除。反应完成后，加入反应混合物约0.5～2倍体积的水洗反应产物，收集有机相，过无水Na2SO4，即得产物O-乙基-硫代磷酰二氯；2)按投料比为2∶1～5∶1将分别溶于水的γ-羟基丁酸钠和溶于二氯甲烷的溴化苄置圆底三口烧瓶中，再加入1～10g四丁基溴化铵作为相转移催化剂，经过2～4天剧烈的搅拌反应。反应完成后，将有机相分离层过无水Na2SO4，浓缩收集液，得4-羟基丁酸苄酯的油状产物；3)按投料比为5∶1～2∶1将溶于等体积无水THF中的O-乙基-硫代磷酰二氯和三氯吡啶酚钠或三氯吡啶酚，装入置于冰水浴中的圆底三口烧瓶中，搅拌反应10～15min，再加入与三氯吡啶酚钠或三氯吡啶酚等摩尔的三乙胺。搅拌反应1～3h后，过滤反应混合物得棕红色滤液，浓缩至干，得棕黄色油脂状物质。过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为3∶1～2∶1的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，洗脱液浓缩至干得棕黄色O-乙基-O-{3，5，6-三氯-(2-吡啶基)}硫代磷酰氯的油状物；4)按投料比为2∶3∶3～1∶6∶6将溶于等体积无水THF中的O-乙基-O-{3，5，6-三氯-(2-吡啶基)}硫代磷酰氯、4-羟基丁酸苄酯和三乙胺，装入圆底三口烧瓶中，在室温下搅拌反应12～24h。反应完成后，过滤产物，浓缩滤液得棕红色油状物，然后加入0.5～10mL饱和氢溴酸-冰醋酸，在磁力搅拌下反应1～2h，待反应完成后，加入0.5～2mol/L的NaHCO3溶液调节溶液pH值到9～10，转移到分液漏斗中，用乙醚萃取2次，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至1～3，用乙酸乙酯萃取3次，有机相过无水Na2SO4，减压浓缩近干，得棕红色油状物，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为1∶4～1∶3的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，洗脱液浓缩至干得O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯黄褐色晶体。
人工半抗原O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯的制备方法是按投料比为1∶1～10∶1将溶于等体积无水乙醇的3-巯基丙酸和毒死蜱，装入圆底三口烧瓶中，然后加入4～10gNaOH或KOH，放在有加热功能的磁力搅拌器上加热搅拌反应，回流反应1～2h，过滤反应混合物，减压浓缩近干。然后用5～10％NaHCO3溶液调节溶液pH值到9～10，转移到分液漏斗中，用正己烷萃取1～2次，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至1～3，用二氯甲烷萃取1～3次，有机相过无水Na2SO4，减压浓缩近干，得棕红色油状物。过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为1∶2～1∶1的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，减压浓缩近干，加入少量无水乙醇溶解产物，冷却后即析出O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯浅黄色晶体。
毒死蜱人工抗原，其特征在于它的分子结构式为 其中n＝2～6。
毒死蜱人工抗原的制备方法是将50～80微摩尔半抗原，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中；或者将80～100微摩尔半抗原溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应1～2小时后，反应液500～800μL加入到8～10mL20mg/mL的OVA碳酸缓冲溶液中，然后在伴有磁力搅拌情况下反应2～4小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
毒死蜱特异抗体制备方法的步骤如下1)实验选用半周岁左右，体重为2～3公斤，健康的雄性家兔或者小鼠。实验免疫剂量基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～2.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫4～6点，大腿肌肉注射2～4点，3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就可进行采血，分离出抗血清；2)采用辛酸-硫酸铵盐析法，或者采用蛋白A柱层析得到抗血清中的IgG。
毒死蜱特异抗体用于检测食品、植物和环境土壤与水等样品中毒死蜱的残留量。
本发明是通过设计最适的半抗原制备相应的人工抗原，从而获得对目标分析物具有特异性识别的抗体，用于快速准确分析食品、植物和环境土壤与水等样品中毒死蜱的残留量。这种方法灵敏度高、特异性强、样品前处理简单、检测费用低，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。
具体实施例方式
本发明的总体技术方案如下选择确定目标分析物→半抗原的合成→人工抗原的制备→特异性抗体的制备→ELISA方法建立与鉴定→实际样本的分析。
首先根据小分子免疫化学基本原理，设计、合成毒死蜱半抗原，突出目标分子特异性部位，制备人工抗原和包被抗原，再用人工抗原免疫和诱导动物机体产生对呋喃丹特异性抗体，进一步探讨相应抗原抗体免疫化学特性，筛选有效抗体，研究和建立灵敏的ELISA方法，并应用于实际样本的分析。
其中半抗原的合成是方法的关键所在，为突出毒死蜱分子特异性抗原决定簇，分别从毒死蜱分子的两个不同位点引入连接臂，合成毒死蜱的半抗原。以毒死蜱为起始原料，在碱性条件下与3-羟基丙酸反应，合成了半抗原O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯(简称AR)；以三氯硫磷等为原料，经过四步反应，合成了半抗原O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯(简称PO)，通过碳二亚胺法与BSA偶联制备具有免疫原性的人工抗原，免疫动物可产生呋喃丹的高亲合性抗体，并具有相应的特异性。以此抗体为基础建立的ELISA方法可用于检测水、土壤及蔬菜等的毒死蜱残留量，与常规GC和HPLC相比，具有快速、简单、灵敏、廉价等特点。实施例1毒死蜱抗体的制备1.半抗原的合成与鉴定农药小分子必须与大分子物质连接后才能刺激动物产生特异性抗体，这已成为小分子免疫分析的基本模式。因此，半抗原的合成与鉴定试验是产生特异性抗体和建立农药残留快速检测技术研究最基础和最关键的步骤。理想的半抗原一方面应具备待测物的特征结构，特别是立体化学特征，另一方面半抗原与载体连接后应保证待测物的特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合，以制备出具有预期选择性的抗体。①半抗原通常由待测物衍生化制备，或由原料合成，待测物的代谢或降解产物往往是有用的半抗原；②除待测物特征结构外，在半抗原的未端需有可直接或间接与载体蛋白质偶联的活性基团；③在活性基团与载体之间，必须有一定长度的间隔臂，以便使半抗原突出于载体表面，易为有机免疫系统识别；④间隔臂应远离待测物的特征结构部分和官能团；⑤半抗原的设计应考虑到农药原型和有毒理学意义的代谢物，以及测定对象是单一的农药或某一类农药；⑥从机体的免疫应答是个十分复杂的生化过程，半抗原诱导的抗体的选择性和亲合性尚难预测，多数情况下宜合成几种结构的半抗原进行研究。基于毒死蜱吡啶环上第六位Cl原子很容易通过亲核取代反应被取代，据此以毒死蜱为起始原料，在碱性条件下与3-羟基丙酸反应，合成了半抗原O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯(简称AR)；基于毒死蜱吡啶环结构可能是其活性官能团，以三氯硫磷等为原料，经过四步反应，合成了半抗原O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯(简称PO)，(使毒死蜱分子的化学结构与电子分布几乎不受影响，这为获得对毒死蜱有高度特异性的抗体提供了保证)。
1.1半抗原(AR)的合成按投料比为1∶1～10∶1将溶于等体积无水乙醇的3-巯基丙酸和毒死蜱，装入圆底三口烧瓶中，然后加入4～10gNaOH或KOH，放在有加热功能的磁力搅拌器上加热搅拌反应，回流反应1～2h，过滤反应混合物，减压浓缩近干。然后用5～10％NaHCO3溶液调节溶液pH值到9～10，转移到分液漏斗中，用正己烷萃取1～2次，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至1～3，用二氯甲烷萃取1～3次，有机相过无水Na2SO4，减压浓缩近干，得棕红色油状物。过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为1∶2～1∶1的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，减压浓缩近干，加入少量无水乙醇溶解产物，冷却后即析出O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯浅黄色晶体。
1.2产物(AR)的鉴定取上述合成的产物分别经ESI、1H-NMR和IR测定其分子结构。该物质的ESI分子离子标准峰为442(M++23)，且该峰旁有一同位素峰，其峰高为442峰的2/3强，由此可知该物质有两个Cl原子。靠近442峰的402峰，应为该物质去掉羟基(-OH)后的离子峰。由此可初步确定合成物质为目标产物；1H-NMR(CDCl3)为δ7.65(s，H，ArH)，4.29～4.35(q+q，4H，2CH2O)，3.39～3.43(t，2H，SCH2)，2.91～2.94(t，2H，CH2COO)，1.27～1.42(t，6H，2CH3)，与文献值相符；IR(KBr压片)cm-1为2989(s～m，C-CH3)，17.11(s，C＝O，饱和脂肪酸)，1541(m，C＝N，吡啶)，1402(s，C-C，芳香族)，1246(s～m，P-O-C，芳香族)，1068(s～m，C-S，芳香族)，1019(s，P-O-C，脂肪族)，862(s～m，P＝S)及828(s～m，C-Cl，芳香族)。从以上分析综合可知，所合成的产物为目标物。
1.3半抗原(PO)的合成与鉴定1)二氯产物的制备按投料比为3∶1～6∶1将PSCl3和无水乙醇，装入置于-10℃±5℃的冰盐水浴中圆底三口烧瓶中，在磁力搅拌下，反应温度控制在-5℃±2℃，反应1～4h，副产物HCl用负压排除。反应完成后，加入反应混合物约0.7倍体积的水洗反应产物，收集有机相，过无水Na2SO4，即得产物O-乙基-硫代磷酰二氯；
2)4-羟基丁酸苄酯的制备按投料比为2∶1～5∶1将分别溶于水的γ-羟基丁酸钠和溶于二氯甲烷的溴化苄置圆底三口烧瓶中，再加入1～10g四丁基溴化铵作为相转移催化剂，经过2～4天剧烈的搅拌反应。反应完成后，将有机相分离层过无水Na2SO4，浓缩收集液，得4-羟基丁酸苄酯的油状产物；3)O-乙基-O-{3，5，6-三氯-(2-吡啶基)}硫代磷酰氯(PO-a)的制备按投料比为5∶1～2∶1将溶于等体积无水THF中的O-乙基-硫代磷酰二氯和三氯吡啶酚钠或三氯吡啶酚，装入置于冰水浴中的圆底三口烧瓶中，搅拌反应10～15min，再加入与三氯吡啶酚钠或三氯吡啶酚等摩尔的三乙胺。搅拌反应1～3h后，过滤反应混合物得棕红色滤液，浓缩至干，得棕黄色油脂状物质。过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为3∶1～2∶1的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，洗脱液浓缩至干得棕黄色O-乙基-O-{3，5，6-三氯-(2-吡啶基)}硫代磷酰氯的油状物；4)O-乙基-O-丁酸羧基-{3，5，6-三氯-(2-吡啶基)}硫逐磷酸酯(PO)的制备按投料比为2∶3∶3～1∶6∶6将溶于等体积无水THF中的O-乙基-O-{3，5，6-三氯-(2-吡啶基)}硫代磷酰氯、4-羟基丁酸苄酯和三乙胺，装入圆底三口烧瓶中，在室温下搅拌反应12～24h。反应完成后，过滤产物，浓缩滤液得棕红色油状物，然后加入0.5～10mL饱和氢溴酸-冰醋酸，在磁力搅拌下反应1～2h，待反应完成后，加入0.5～2mol/L的NaHCO3溶液调节溶液pH值到9～10，转移到分液漏斗中，用乙醚萃取2次，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至1～2，用乙酸乙酯萃取3次，有机相过无水Na2SO4，减压浓缩近干，得棕红色油状物，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为1∶4～1∶3的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，洗脱液浓缩至干得O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯黄褐色晶体。该产物1H-NMR(CDCl3)为δ7.87(s，1H，ArH)，4.43(q+q，4H，CH2O)，2.59(t，2H，CH2COO)，2.11(m，2H，CH2)，1.43(t，3H，CH3)；其EI-MS，m/z为409(4，M++2)，407(4，M+)，372(9)，370(6)，322(28)，288(53)，286(57)，260(31)，258(36)，199(88)，197(88)，171(85)，69(100)。
实施例2人工抗原的合成基本方法是首先将半抗原活化，然后在水介质及温和的条件下与载体蛋白质偶联。偶联的方法取决于半抗原的活性基团含-COOH和-NH2的半抗原一般采用合成肽的方法，含有-SH和-OH的半抗原需采用双功能团试剂，生成带有-COOH和-NH2的化合物后再进行偶联。脂溶性半抗原偶联时应在反应介质中加入适量水溶性有机溶剂，如N，N-二甲基甲酰胺，以改善半抗原在介质中的溶解性和反应效率。各种蛋白质参与反应的基团相同，如氨基、羧基、酚基、咪唑基等。常用的蛋白有牛血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白等。
2.1免疫原的合成与纯化免疫原的合成利用碳二亚胺法。将50～80微摩尔半抗原，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中；或者将80～100微摩尔半抗原溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应1～2小时后，反应液500～800μL加入到8～10mL20mg/mL的OVA碳酸缓冲溶液中，然后在伴有磁力搅拌情况下反应2～4小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
2.2包被抗原的合成与纯化包被抗原的合成利用混合酸酐法。将50～80微摩尔半抗原，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应1小时后，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应2～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中；或者将80～100微摩尔半抗原溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应1～2小时后，反应液500～800μL加入到8～10mL20mg/mL的OVA碳酸缓冲溶液中，然后在伴有磁力搅拌情况下反应2～4小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
2.3人工抗原的鉴定按照Chen P.S.的方法用721型分光光度计测定偶联物中磷的含量，计算其结合比。按照合成毒死蜱免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)。偶联物AR-BSA和AR-OVA分别在278.6nm和277.9nm处出现最大吸收峰，与AR、BSA和OVA的吸收峰相比，发生了明显的变化，表明人工抗原AR-BSA和AR-OVA的合成是成功的。偶联物PO-BSA和PO-OVA分别在279.4nm和276.7nm处出现最大吸收峰，与PO、BSA和OVA的吸收峰相比，发生了明显的变化，表明人工抗原PO-BSA和PO-OVA的合成亦是成功的。
经计算结果如下AR-BSA20～40∶1 PO-BSA 15～30∶1AR-OVA5～20∶1PO-OVA 5～20∶1实施例3抗体的制备3.1免疫动物制备抗血清实验选用半周岁左右，体重为2-3公斤，健康的雄性家兔。每种免疫原免疫三只兔子(由浙江省中医学院负责兔子的饲养工作)，分别编号为兔子1-6。
实验免疫剂量基础免疫为0.25mg/kg，加强免疫剂量为0.5mg/kg，用生理盐水分别稀释适量AR-BSA和PO-BSA复合物，加入等体积弗氏完全佐剂(加强免疫时采用弗氏不完全佐剂)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫6点，大腿肌肉注射2点，4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后第8天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。
待免疫血清效价上去后，就可进行采血。本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，先待收集在三角烧瓶中的血液凝固后，然后用接种针沿三角烧瓶边缘将血块与玻璃脱离，放置于37℃温箱中半小时，再放到4℃冰箱中3～4小时，待血块收缩后，用毛细吸管将血清吸入试管中，以3000rpm离心15分钟，分离出血清。兔子1得血清20mL，兔子4得血清25mL。
3.2抗血清效价测定两种免疫原复合物按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价分别为1∶25600、1∶12800、1∶51200、1∶51200、1∶51200和1∶102400(指OD450nm值大于1.0)。
3.3抗体的纯化与鉴定一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。
3.4抗体的特异性用具有多种抗原决定簇的免疫原(蛋白质或多肽)制备的抗血清，其中含的抗体分子往往是混合体。当有甲、乙两种抗原，其分子结构中具有相同或部分相同的抗原决定簇时，甲抗原可与乙抗原的抗血清反应，而乙抗原也可与甲抗原抗血清反应，称为交叉反应。抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性则越好。
将特异性抗原及其类似物做系列稀释，分别与同一种抗血清(抗PO-BSA抗体)，按制作标准曲线同样方法制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的剂量和类似物抑制率50％时的用量。然后计算出各类似物的交叉反应率。
抗AR-BSA抗体对各类似物的交叉反应率均小于10.00％，可知该抗体的特异性较好。该抗体对硫代磷酸酯类有机磷农药交叉反应率甲基毒死蜱为183％，皮蝇磷为3.8％，溴硫磷为1.4％，毒壤磷为1.3％，除线磷为0.67％对硫磷为0.16％，三氯吡啶醇为1.5％。
抗PO-BSA抗体对硫代磷酸酯类有机磷农药交叉反应率甲基毒死蜱为114％，皮蝇为4.6％，溴硫磷为4.4％，毒壤磷为5.3％，三氯吡啶醇＜0.01％。
从而可知，所制备的两种抗体的特异性均较强。
实施例4毒死蜱酶联免疫吸附测定方法建立与鉴定4.1毒死蜱ELISA测定方法的建立及其工作条件和基本参数采用间接竞争酶联免疫分析方法。其测定原理已作了简单论述，现作一详细论述。它是将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗原，然后加入待测农药和相应抗体，固相抗原中的农药，待测农药，与抗体进行竞争结合反应，待测农药含量多，则被结合在固相抗原上的抗体少，反之结合在固相抗原的抗体多，反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合)，最后用底物进行显色加以测定，当抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，发色反应就减弱，抑制率增高，反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而可根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率，推算出待测农药的浓度。
4.2最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定用方阵滴定法，同时稀释抗血清和固相抗原包被液。
在同一包被液浓度下，随着抗血清的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗血清稀释浓度下，随着包被液浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。同时从实验可知，当抗血清稀释倍数为8000，包被抗原浓度为0.5μg.mL-1时OD值处于1.0左右，且根据通常选择1.0(结合率＝1.0)左右的抗血清和包被抗浓度作为工作浓度，于是选择抗血清8000倍稀释作为最适工作浓度，包被抗原浓度0.5μg.mL-1作为最佳包被浓度。
4.3标准曲线和检测灵敏度4.3.1标准曲线的制备，其基本的操作步骤如下4.3.1.1包被1)包被抗原溶液的配制从低温冰箱中取出一管AR-OVA或PO-OVA偶联复合物，使之完全解冻后，用移液枪从中取10μL，用包被液稀释成40mL，即为0.5μg/mL的包被抗原溶液。
2)微量反应板的包被96孔聚苯乙烯微量反应板用蒸馏水洗涤后，每孔加入上面所配的抗原包被液100μL，于37℃温箱中温育2h。
4.3.1.2微量反应板的封闭取出包被好的微量反应板，甩掉包被液，然后用蒸馏水洗涤，每孔加入1.5％的脱脂奶100μL，于37℃温箱中温育0.5h。
4.3.1.3点板1)配制毒死蜱的标准溶液取毒死蜱标样配制100ppm的标准溶液，从中取出200μL，待溶剂丙酮挥发后，加入2mLPBST溶液，使之成10ppm溶液，再作倍比稀释，稀释成12个浓度。
2)毒死蜱抗血清稀释液的配制从冰箱中取出经冷冻处理的抗血清，待完全解冻后，从中用移液枪取出10μL，用PBST作8000倍稀释3)点板取出经封闭的板，经PBST洗涤两次后，每孔加入经系列稀释制备出的毒死蜱各浓度标准液50μL，再加入抗血清稀释液50μL，对照孔加入PBST50μL和抗血清稀释液50μL。放入37℃温箱中温育1h，弃去孔内液体，用PBST溶液洗涤3次。
4.3.1.4加酶标二抗每孔加入经1∶2000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶PBST溶液100μL，放入37℃温箱中1小时，用PBST溶液洗涤3次，甩干。
4.3.1.5显色每孔加入底物TMB-过氧化氢尿素溶液100μL，37℃温箱中温育15min后用50μL 2MH2SO4终止反应。在酶联仪上测定450nm波长下的吸光值。根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算 式中ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得毒死蜱各浓度的抑制率，作图。用抗AR-BSA抗体测定时，抑制率为50％时毒死蜱的浓度为0.63ppm，最低检测限(以直线部分最低点的浓度表示)为0.005ppm；用抗PO-BSA抗体测定时，抑制率为50％时毒死蜱的浓度为0.82ppm，最低检测限同样也为0.005ppm。从图中还可知，毒死蜱在0.005ppm-10.00ppm范围内，抑制率与毒死蜱浓度的对数值呈显著的线性关系，抗AR-BSA抗体的相关系数为r＝0.9896，抗PO-BSA抗体的相关系数为r＝0.9862。
4.4精密度精密度(Precision)是指方法的重复性。如果一个分析方法测定结果的重复性很差，就无法评价其灵敏度，特异性和准确度，也就无法得出令人信服的结果，在ELISA实验中，常采用批内和批间误差来表示其精密度。
1)批内误差以标准曲线的批内平均变异系数来表示。标准曲线12个剂量点的批内平均变异系数CV％＝7.32％。
2)批间误差以6块不同板上的测定结果进行平均，求得标准曲线12个剂量点的批间平均变异系数CV％＝10.90％。
从批内和批间的数据可以看出，毒死蜱含量高的样品在测定过程中，其重复性较好，批内批间的变异也较小，且批内批间相差也较小。
4.5准确度准确度(Accuracy)是指测得值与真值的符合程度。在农药ELISA实验中，以回收率和健全性来表示其准确度。
4.5.1回收率在10g甘蓝中添加一定量的农药标样，提取液作适当的稀释后用于ELISA分析，甘蓝样品未添加毒死蜱时，样品提取液作2倍稀释即能使母质的影响消除，所以在该实验中对样品提取液均作2倍稀释。根据ELISA测得的OD值及抑制率从标准曲线上查得农药的含量，然后再换算得样品中农药的含量，进而计算回收率。回收率越高，则说明测得值与真值接近程度越好，方法越可靠；若回收率较低，则方法的可信度便较差。
经分析可知，该方法的平均回收率为96.12％，平均变异系数为9.45％，且毒死蜱的添加量为0.50ppm以上时，方法的变异系数均小于10.00％，而小于0.50ppm时，方法的变异系数为10-20％之间。随着农药添加量的降低，回收率基本上也呈现下降的趋势。
在制作标准曲线时，得到的检测极限为0.005ppm，而在测定甘蓝样品的过程中，对其提取液作了2倍的稀释，换算可得用此方法检测甘蓝中的毒死蜱检测限可达0.01ppm，而用气相色谱硫磷检测器时对毒死蜱的检测限为0.02ppm，从而可知用ELISA分析方法来测定甘蓝中毒死蜱量是可行的。且与气相色谱相比，ELISA分析方法样品的前处理快捷简单，只用丙酮提取后浓缩定容即可进行检测，而用气相色谱法分析，样品前处理过程复杂，先要用缓冲溶液提取，然后用二氯甲烷萃取，萃取后浓缩，浓缩后又要用小型硅胶柱净化，工作量大，所花所以建立毒死蜱的ELISA分析方法能够大大提高工作效率。
以毒死蜱标样添加量为横轴，回收量为纵轴作图，得回归曲线，从而得毒死蜱在甘蓝中回收的直线方程为y＝1.0369x-76.18(R2＝0.9991)4.5.2健全性将添加10ppm毒死蜱的甘蓝样品的提取液在作了2倍稀释后作系列稀释，进行重叠性试验，样品提取液的稀释曲线基本上与标准曲线平行。说明所测样品与标准样品的免疫化学性质相同，可以通过标准曲线检测被测物质，也说明测定结果不会因样品稀释度的改变而发生显著变化。
4.6用于毒死蜱残留分析的间接竞争ELISA的基本参数在ELISA实验中，实验进行所需pH值、温度、时间等参数都均能影响抗原和抗体的结合反应。所以在免疫分析中，这些因子都应加以确定，使之达到最优化。同时此表中列出了以上实验中所得的该方法的检测极限等内容。实施例5样品快速测定初探5.1提取方法(1)将甘蓝样品切碎后，称14份，每份10g，分别装入三角瓶中。(2)配制三个不同水平的毒死蜱丙酮溶液。药液浓度分别为100ppm、10ppm、1ppm，分别从中取0.5mL和1mL加入到样品中，重复二次，共12个样品，余下的二个作对照。(3)一定时间后，在样品中加入50mL的丙酮放在国际型振荡器上振荡提取15分钟。(4)振荡完毕后，提取液用布氏漏斗抽滤，用30mL的丙酮冲洗滤渣，抽滤完毕后，移入到250mL的容量瓶中。(5)用旋转蒸发器浓缩至2mL左右，用PBST定容至10mL。
5.2配制抗血清稀释液方法同标准曲线部分。
5.3点板已包被好的板每孔加入系列已知添加浓度的样品液50μL，再加入抗血清稀释液50μL，对照孔加入100μL抗血清，盖好板，37℃温育2小时，弃去孔内液体，余后步骤同前。
权利要求
1.一种毒死蜱人工半抗原，其特征在于它的分子结构式为 其中PO为O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯 AR为O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯
2.一种人工半抗原O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯的制备方法，其特征在于它的步骤如下1)按投料比为3∶1～6∶1将PSCl3和无水乙醇，装入置于-10℃±5℃的冰盐水浴中圆底三口烧瓶中，在磁力搅拌下，反应温度控制在-5℃±2℃，反应1～4h，副产物HCl用负压排除。反应完成后，加入反应混合物约0.5～2倍体积的水洗反应产物，收集有机相，过无水Na2SO4，即得产物O-乙基-硫代磷酰二氯；2)按投料比为2∶1～5∶1将分别溶于水的γ-羟基丁酸钠和溶于二氯甲烷的溴化苄置圆底三口烧瓶中，再加入1～10g四丁基溴化铵作为相转移催化剂，经过2～4天剧烈的搅拌反应。反应完成后，将有机相分离层过无水Na2SO4，浓缩收集液，得4-羟基丁酸苄酯的油状产物；3)按投料比为5∶1～2∶1将溶于等体积无水THF中的O-乙基-硫代磷酰二氯和三氯吡啶酚钠或三氯吡啶酚，装入置于冰水浴中的圆底三口烧瓶中，搅拌反应10～15min，再加入与三氯吡啶酚钠或三氯吡啶酚等摩尔的三乙胺。搅拌反应1～3h后，过滤反应混合物得棕红色滤液，浓缩至干，得棕黄色油脂状物质。过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为3∶1～2∶1的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，洗脱液浓缩至干得棕黄色O-乙基-O-{3，5，6-三氯-(2-吡啶基)}硫代磷酰氯的油状物；4)按投料比为2∶3∶3～1∶6∶6将溶于等体积无水THF中的O-乙基-O-{3，5，6-三氯-(2-吡啶基)}硫代磷酰氯、4-羟基丁酸苄酯和三乙胺，装入圆底三口烧瓶中，在室温下搅拌反应12～24h。反应完成后，过滤产物，浓缩滤液得棕红色油状物，然后加入0.5～10mL饱和氢溴酸-冰醋酸，在磁力搅拌下反应1～2h，待反应完成后，加入0.5～2mol/L的NaHCO3溶液调节溶液pH值到9～10，转移到分液漏斗中，用乙醚萃取2次，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至1～3，用乙酸乙酯萃取3次，有机相过无水Na2SO4，减压浓缩近干，得棕红色油状物，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为1∶4～1∶3的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，洗脱液浓缩至干得O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯黄褐色晶体。
3.一种人工半抗原O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯的制备方法，其特征在于按投料比为1∶1～10∶1将溶于等体积无水乙醇的3-巯基丙酸和毒死蜱，装入圆底三口烧瓶中，然后加入4～10gNaOH或KOH，放在有加热功能的磁力搅拌器上加热搅拌反应，回流反应1～2h，过滤反应混合物，减压浓缩近干。然后用5～10％NaHCO3溶液调节溶液pH值到9～10，转移到分液漏斗中，用正己烷萃取1～2次，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至1～3，用二氯甲烷萃取1～3次，有机相过无水Na2SO4，减压浓缩近干，得棕红色油状物。过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为1∶2～1∶1的正己烷/乙酸乙酯洗脱相，减压浓缩近干，加入少量无水乙醇溶解产物，冷却后即析出O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯浅黄色晶体。
4.一种毒死蜱人工抗原，其特征在于它的分子结构式为1) 其中n＝2～6。
5.一种毒死蜱人工抗原的制备方法，其特征在于将50～80微摩尔半抗原，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中；或者将80～100微摩尔半抗原溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应1～2小时后，反应液500～800μL加入到8～10mL20mg/mL的OVA碳酸缓冲溶液中，然后在伴有磁力搅拌情况下反应2～4小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
6.一种毒死蜱特异抗体制备方法，其特征在于它的步骤如下1)实验选用半周岁左右，体重为2～3公斤，健康的雄性家兔或者小鼠。实验免疫剂量基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～2.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫4～6点，大腿肌肉注射2～4点，3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就可进行采血，分离出抗血清；2)采用辛酸-硫酸铵盐析法，或者采用蛋白A柱层析得到抗血清中的IgG。
7.一种毒死蜱特异抗体的用途，其特征在于它用于检测食品、植物和环境土壤与水等样品中毒死蜱的残留量。
全文摘要
本发明是关于毒死蜱人工抗原和特异性抗体制备方法及其应用，属于农药免疫化学技术领域。以乙基毒死蜱(O，O－二乙基－O－(3，5，6－三氯－2－吡啶基)硫逐磷酸酯)为例，它在碱性条件下与3－羟基丙酸反应，合成了半抗原O，O－二乙基－O－[3，5－二氯－6－(2－羧乙基)硫代－2－吡啶基]硫逐磷酸酯(简称AR)；同时以三氯硫磷等为原料，经过四步反应，合成了半抗原O－乙基－O－[3，5，6－三氯－(2－吡啶基)]－O－(3－羧丙基)硫逐磷酸酯(简称PO)。然后通过碳二亚胺法和混合酸酐法与蛋白质偶联制备人工抗原。将人工抗原免疫动物后产生对毒死蜱高亲合力的特异性抗体。这种抗体与其他化合物不易发生交叉反应。用该抗体建立的酶联免疫吸附分析法可用于快速、灵敏、方便、廉价地检测样本痕量的毒死蜱残留。
文档编号C07F9/09GK1431213SQ0311489
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月13日 优先权日2003年1月13日
发明者朱国念, 吴刚, 程敬丽, 吴慧明, 魏方林 申请人:浙江大学